芒柄花素调节JAK2/STAT3信号通路对妊娠高血压大鼠的治疗作用

刘洋 赵巧棉 杨颖 李丽英 栾燕东

摘要 目的：探討芒柄花素（FMN）对妊娠高血压（PIH）大鼠的治疗作用及可能机制。方法：将妊娠大鼠分为正常组（Normal组，生理盐水）、PIH组（生理盐水）、FMN组［40 mg/（kg·d） FMN）］、Janus激酶2（JAK2）抑制剂组［AG490组，5 mg/（kg·d） AG490］、FMN＋JAK2抑制剂组［FMN＋AG490组，40 mg/（kg·d） FMN＋5 mg/（kg·d） AG490］，每组12只。除Normal组外，其余各组大鼠连续4 d皮下注射125 mg/（kg·d） L-精氨酸甲酯构建PIH模型。观察大鼠尾静脉压、24 h尿蛋白含量，血清血管内皮因子［内皮素1（ET-1）、一氧化氮（NO）］、炎性因子［肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素6（IL-6）］、心肌损伤指标［肌酸激酶同工酶MB（CK-MB）、心肌肌钙蛋白I（cTnI）］、肾损伤指标［血尿素氮（BUN）、血肌酐（SCr）］水平，心肌、肾组织病理学变化及心肌、肾组织中氧化应激指标［丙二醛（MDA）和总超氧化物歧化酶（T-SOD）］和JAK2/信号转导和转录激活因子3（STAT3）信号通路相关蛋白（JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3）表达。结果：给药结束后，与Normal组比较，PIH组大鼠尾静脉压、24 h尿蛋白含量升高，血清ET-1、TNF-α、IL-6、CK-MB、cTnI、BUN、SCr水平及心肌、肾组织中MDA含量和p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比值升高（P＜0.05），血清NO水平和心肌、肾组织中T-SOD活性降低（P＜0.05），且心肌、肾组织存在明显的病理损伤。与PIH组比较，FMN组、AG490组和FMN＋AG490组大鼠尾静脉压、24 h尿蛋白含量降低，血清ET-1、TNF-α、IL-6、CK-MB、cTnI、BUN、SCr水平及心肌、肾组织中MDA含量和p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比值降低（P＜0.05），血清NO水平和心肌、肾组织中T-SOD活性升高（P＜0.05），且心肌、肾组织病理损伤均有所改善；其中FMN＋AG490组上述指标变化均显著优于FMN组、AG490组。结论：FMN可能通过抑制JAK2/STAT3信号通路，减轻心肌、肾组织中氧化应激和全身炎症反应，改善血管内皮舒缩功能，降低血压，减轻PIH大鼠心肌、肾组织损伤。

关键词 妊娠高血压；芒柄花素；Janus激酶2/信号转导和转录激活因子3信号通路；大鼠；实验研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.05.009

Therapeutic Effects of Formononetin Regulating JAK2/STAT3 Signaling Pathway on Rats with Pregnancy-induced Hypertension

LIU Yang， ZHAO Qiaoman， YANG Ying， LI Liying， LUAN Yandong

Chengde Maternal and Child Health Care Hospital， Chengde 067000， Hebei， China

Corresponding Author LI Liying， E-mail： 414627754@qq.com

Abstract Objective：To investigate the therapeutic effect of formononetin（FMN） on rats with  pregnancy-induced hypertension（PIH） and its possible mechanism.Methods：Pregnant rats were divided into Normal group（normal saline），PIH group（normal saline），FMN group［40 mg/（kg·d） FMN］，Janus kinase 2（JAK2） inhibitor group［AG490 group，5 mg/（kg·d） AG490］，FMN＋JAK2 inhibitor group［FMN＋AG490 group，40 mg/（kg·d） FMN＋5 mg/（kg·d） AG490］，with 12 rats in each group.Except Normal group，the rats in other groups were subcutaneously injected 125 mg/（kg·d） L-arginine methyl ester for 4 consecutive days to establish PIH model.The tail venous pressure of rats and 24 h urinary protein content were observed.Serum vascular endothelial factors［endothelin 1（ET-1），nitric oxide（NO）］，inflammatory factors［tumor necrosis factor α（TNF-α），interleukin 6（IL-6）］，myocardial injury indexes［creatine kinase isoenzyme MB（CK-MB），myocardial troponin I（cTnI）］，kidney injury indexes［blood urea nitrogen（BUN），serum creatinine（SCr）］ levels，histopathological changes of myocardium and kidney，and expression of oxidative stress indicators［malondialdehyde（MDA） and total superoxide dismutase（T-SOD）］ and JAK2/signal transduction and transcriptional activator 3（STAT3） signaling pathway-related proteins（JAK2，p-JAK2，STAT3，p-STAT3） in myocardium and kidney were detected.Results：After administration，compared with the normal group，tail venous pressure and 24 h urinary protein content in the PIH group，serum ET-1，TNF-α，IL-6，CK-MB，cTnI，BUN，SCr，MDA content and p-JAK2/JAK2 and p-STAT3 /STAT3 ratio in myocardial and kidney tissues  increased（P＜0.05）.Serum NO level and T-SOD activity in myocardium and kidney tissues decreased（P＜0.05），and there were obvious pathological injuries in myocardium and kidney tissues.Compared with the PIH group，the tail venous pressure，24 h urinary protein content in the FMN group，AG490 group and FMN＋AG490 group，Serum ET-1，TNF-α，IL-6，CK-MB，cTnI，BUN，SCr levels，MDA content and p-JAK2 /JAK2 and p-STAT3 /STAT3 ratios in myocardial and kidney tissues  decreased（P＜0.05）.Serum NO level and T-SOD activity in myocardium and kidney tissue increased（P＜0.05），and the pathological damage of myocardium and kidney tissue  improved，while the above indexes in the FMN＋AG490 group were significantly better than those in the FMN group and AG490 group.Conclusion：Formononetin might inhibit JAK2/STAT3 signaling pathway，reduce oxidative stress and systemic inflammation in myocardium and kidney tissue，improve vascular endothelial function，decrease blood pressure，and alleviate myocardial and kidney tissue damage in rats with gestational hypertension.

Keywords pregnancy-induced hypertension; formononetin; Janus kinase 2/signal transduction and activator of transcription 3 signaling pathway; rats; experimental study

基金项目 河北省承德市科学技术研究与发展计划项目（No.202109A011）

作者单位 1.承德市妇幼保健院（河北承德  067000）；2.承德市荣复军人医院

通讯作者 李丽英，E-mail：414627754@qq.com

引用信息 刘洋，赵巧棉，杨颖，等.芒柄花素调节JAK2/STAT3信号通路对妊娠高血压大鼠的治疗作用［J］.中西医结合心脑血管病杂志，2024，22（5）：823-828.

妊娠高血压（pregnancy-induced hypertension，PIH）是临床常见的妊娠期并发症，也是导致孕产妇和胎儿发病率和死亡率的主要原因之一［1］。PIH严重危害孕妇的脏器，如心脏、肾脏等，寻找既能预防PIH孕妇心脑血管疾病等并发症又不危及胎儿健康的药物也是一直不懈努力的科研方向［2］。芒柄花素又称芒柄花黄素、刺芒柄花素（formononetin，FMN），是一种从红三叶草等药用草本植物中分离提纯得到的一种天然植物雌激素，其通过多种分子途径发挥抗肿瘤、抗炎、抗氧化、降压等药理作用［3-4］。然而，FMN对PIH的治疗效果尚未明确。相关研究表明，FMN通过降低血管周围炎症和细胞外基质沉积，减轻野百合碱所致大鼠肺动脉高压［5］；通过抑制炎症和氧化应激预防顺铂诱导的急性肾损伤［6］；通过增强自噬降解保护衰老的心脏免受缺血/再灌注损伤［7］。Janus激酶2（Janus kinase 2，JAK2）/信号转导和转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）通路是一条与炎症反应、氧化应激损伤密切相关的信号转导途径［8-9］。有研究显示，FMN可能通过抑制JAK2/STAT3信号通路中的相关靶点发挥抗炎作用，对脑缺血再灌注损伤具有一定的保护作用［10］。基于上述研究结果，推测FMN可能通过抑制JAK2/STAT3信号通路对PIH诱导的心脏、肾脏损伤发挥治疗作用。本研究以PIH大鼠为模型，探讨FMN对PIH诱导心脏、肾脏损伤的保护效果，并阐明其作用机制，以期为PIH治疗药物的研发提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

无特定病原体（SPF）级健康SD大鼠雌性60只、雄性30只，7～8周龄，体质量（230±20）g，由北京北方艾特生物科技有限公司提供，动物许可证号：SCXK（京）2020-0005。所有大鼠在恒温、恒湿的屏障环境下饲养，每日接受光/暗循环12 h∶12 h，自由摄食进水。动物实验严格遵循3R原则，符合动物福利和伦理原则。

1.1.2 实验试剂

FMN（纯度≥98%，94334-50MG）购自美国Sigma公司；JAK2抑制剂AG490（纯度99.97%，HY-12000-180322）购自美国MCE公司；L-精氨酸甲酯（纯度99%，S20011-25g）购自上海源叶生物科技有限公司；总蛋白定量测试盒（考马斯亮兰法，KLJC0108）购自上海康朗生物科技有限公司；内皮素1（endothelin 1，ET-1）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、白细胞介素6（interleukin 6，IL-6）酶联免疫吸附法（ELISA）试剂盒（E-EL-R1458c、E-EL-R2856c、E-EL-R0015c）以及苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色试剂盒（E-IR-R117）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）和总超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）比色法测试盒（E-BC-K025-S、E-BC-K019-S）购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；一氧化氮（nitric oxide，NO）ELISA试剂盒（XYH373）购自上海烜雅生物科技有限公司；肌酸激酶同工酶（creatine kinase isoenzyme，CK-MB）、心肌肌钙蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）ELISA试剂盒（CSB-E14403r、CSB-E08594r）购自武汉华美生物工程有限公司；血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、血肌酐（serum creatinine，SCr）ELISA试剂盒（1529050398、JL22955）购自上海江莱生物科技有限公司；磷酸化JAK2（p-JAK2，phospho Y1007＋Y1008）、JAK2、磷酸化STAT3（p-STAT3，phospho S727）、STAT3、β-actin抗体和辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔IgG购自英国Abcam公司（ab32101、ab108596、ab32143、ab68153、ab8227、ab205718）。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组、模型构建与给药

所有大鼠适应性饲养7 d后，以雌性∶雄性为2∶1合笼饲养，次日清晨阴道涂片检查雌性大鼠中精子，发现精子记为妊娠第0天。随机选取12只妊娠大鼠作为正常组（Normal组）；其余各组大鼠从妊娠第13天起，连续4 d皮下注射125 mg/（kg·d） L-精氨酸甲酯構建PIH模型［11］。妊娠第13天、第16天检测大鼠尾静脉压，若增加30 mmHg，提示PIH模型构建成功。将模型构建成功大鼠随机分为PIH组、FMN组、JAK2抑制剂组（AG490组）、FMN＋JAK2抑制剂组（FMN＋AG490组），每组12只。

妊娠第17天，FMN组大鼠灌胃40 mg/（kg·d） FMN［12］；AG490组大鼠尾静脉注射5 mg/（kg·d） AG490［13］；FMN＋AG490组大鼠灌胃40 mg/（kg·d） FMN同时尾静脉注射5 mg/（kg·d） AG490；Normal组、PIH组大鼠灌胃和尾静脉注射等量生理盐水，连续4 d（即干预至妊娠第20天）。

1.2.2 尾静脉压、24 h尿蛋白含量测定

分别于造模后、给药前、给药结束后，将大鼠仰卧位固定于操作台上，采用血压仪测量大鼠尾静脉压，连续检测3次，取平均值；使用代谢笼收集大鼠24 h尿液，通过考马斯亮兰（Bradford）法检测大鼠尿液中尿蛋白含量。

1.2.3 血清血管内皮因子、炎性因子及心肌、肾损伤指标检测

给药后麻醉大鼠，腹主动脉取血，获得血清。严格按照ELISA试剂盒说明进行操作，于酶标仪上检测标准品和血清样品中光密度（OD）值，绘制标准曲线，计算大鼠血清血管内皮因子（ET-1、NO）、炎性因子（TNF-α、IL-6）、心肌损伤指标（CK-MB、cTnI）和肾损伤指标（BUN、SCr）水平。

1.2.4 心肌、肾组织病理学变化观察

取血后迅速摘取心脏、肾脏，采用预冷的磷酸缓冲盐溶液（PBS）洗涤后，一部分心肌、肾组织置于10%的甲醛中固定，另一部分制备新鲜组织匀浆液，剩余部分置于－80 ℃冰箱保存。固定24 h后的心肌、肾组织制备常规石蜡切片（4 μm），参照HE染色试剂盒说明书依次进行苏木素、伊红染色，在光学显微镜下观察大鼠心肌、肾组织病理学变化。

1.2.5 心肌、肾组织氧化应激指标检测

将制备好的新鲜心肌、肾组织匀浆液离心，取上清液，二喹啉甲酸（BCA）法定量上清液中蛋白质浓度，参照商品试剂盒说明书，分别采用硫代巴比妥酸（TBA）法、羟胺法检测大鼠心肌、肾组织中MDA含量和T-SOD活性。

1.2.6 心肌、肾组织中JAK2/STAT3信号通路相关蛋白表达测定

采用蛋白免疫印迹法（Western Blot）检测心肌、肾组织中JAK2/STAT3信号通路相关蛋白表达，具体操作：取出－80 ℃冰箱保存的心肌、肾组织，使用含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液充分裂解组织，提取总蛋白，BCA法定量蛋白浓度；每个样品取30 μg变性蛋白进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），之后将蛋白转移至聚偏乙烯膜（PVDF）；将膜在含5%牛血清蛋白（BSA）的PBS溶液中室温封闭1.5 h，之后将膜置于一抗（p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3、β-actin抗体）稀释液中4 ℃孵育过夜，PBS洗涤后将膜置于二抗（HRP标记羊抗兔IgG）稀释液中37 ℃孵育1 h，电化学发光（ECL）试剂显色；凝胶成像系统扫描图像，采用Image J软件半定量分析蛋白条带灰度，以β-actin为内参。

1.3 统计学处理

采用SPSS 25.0统计软件分析实验数据，符合正态分布、方差齐性的定量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间和组间多重比较采用单因素方差分析、SNK-q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠尾静脉压、24 h尿蛋白含量比较

给药前，PIH组、FMN组、AG490组、FMN＋AG490组大鼠尾静脉压、24 h尿蛋白含量高于Normal组（P＜0.05）。给药后，与Normal组比较，PIH組大鼠尾静脉压、24 h尿蛋白含量升高（P＜0.05）；与PIH组比较，FMN组、AG490组和FMN＋AG490组大鼠尾静脉压、24 h尿蛋白含量降低（P＜0.05）；与FMN组、AG490组比较，FMN＋AG490组大鼠尾静脉压、24 h尿蛋白含量进一步降低（P＜0.05）。详见表1。

2.2 各组大鼠血清血管内皮因子和炎性因子水平比较

与Normal组比较，PIH组大鼠血清ET-1、TNF-α、IL-6水平升高（P＜0.05），NO水平降低（P＜0.05）；与PIH组比较，FMN组、AG490组和FMN＋AG490组大鼠血清ET-1、TNF-α、IL-6水平降低（P＜0.05），NO水平升高（P＜0.05）；与FMN组、AG490组比较，FMN＋AG490组大鼠血清ET-1、TNF-α、IL-6水平进一步降低（P＜0.05），NO水平进一步升高（P＜0.05）。详见表2。

2.3 各组大鼠血清心肌、肾损伤指标比较

与Normal组比较，PIH组大鼠血清CK-MB、cTnI、BUN、SCr水平升高（P＜0.05）；与PIH组比较，FMN组、AG490组和FMN＋AG490组大鼠血清CK-MB、cTnI、BUN、SCr水平降低（P＜0.05）；与FMN组、AG490组比较，FMN＋AG490组大鼠血清CK-MB、cTnI、BUN、SCr水平进一步降低（P＜0.05）。详见表3。

2.4 各组大鼠心肌、肾组织病理学变化

Normal组大鼠心肌、肾组织结构和形态正常，轮廓完整清晰。PIH组大鼠心肌组织中心肌纤维断裂，心肌细胞肿胀和坏死，大量炎性细胞浸润；肾组织中肾小球内皮细胞肿胀和空泡样变性，基底膜增厚，存在炎性浸润。与PIH组比较，FMN组、AG490组和FMN＋AG490组大鼠心肌、肾组织上述病理损伤均有所减轻，且FMN＋AG490组最明显。详见图1。

2.5 各组大鼠心肌、肾组织中氧化应激指标水平比较

与Normal组比较，PIH组大鼠心肌、肾组织中MDA含量升高，T-SOD活性降低（P＜0.05）；与PIH组比较，FMN组、AG490组和FMN＋AG490组大鼠心肌、肾组织中MDA含量降低，T-SOD活性升高（P＜0.05）；与FMN组、AG490组比较，FMN＋AG490组大鼠心肌、肾组织中MDA含量进一步降低，T-SOD活性进一步升高（P＜0.05）。详见表4。

2.6 各组大鼠心肌、肾组织中JAK2/STAT3信号通路相关蛋白表达比较

与Normal组比较，PIH组大鼠心肌、肾组织中p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比值升高（P＜0.05）；与PIH组比较，FMN组、AG490组和FMN＋AG490组大鼠心肌、肾组织中p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比值降低（P＜0.05）；与FMN组、AG490组比较，FMN＋AG490组大鼠心肌、肾组织中p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比值进一步降低（P＜0.05）。详见图2、图3及表5。

3 讨 论

PIH影响着全世界约10%的妊娠期妇女，降压治疗是基础的管理策略，降压治疗不仅可减轻孕产妇严重高血压，而且未增加流产和心脑血管疾病等并发症风险［14-15］。心脏和肾功能受损是PIH普遍存在的病理生理特征，研发减轻心脏和肾功能受损的药物对PIH的有效治疗至关重要［16-17］。

近年来，中药因具有丰富的自然资源、较强的靶向和较低的成本等优势，受到越来越多的关注。FMN是一种从传统中草药中提取的活性异黄酮，具有多种心脏、肾脏保护作用。FMN可改善糖尿病小鼠心肌损伤，减轻心肌纤维化、凋亡及炎症反应［18］；FMN能减轻糖尿病肾病大鼠肾损伤，改善肾功能，抑制肾组织氧化应激［12，19］；FMN可显著改善野百合碱诱导的右心室收缩压、右心室肥厚和肺血管重构，对大鼠肺动脉高压可发挥抑制作用［20］。本研究结果显示，FMN可显著降低PIH大鼠尾静脉压、24 h尿蛋白含量及血清CK-MB、cTnI、BUN、SCr水平，同时明显改善心肌、肾组织病理损伤，表明FMN可降低PIH诱导的高血压，减轻心肌、肾组织损伤。

ET-1、NO是一对常见的血管舒缩因子，其变化可反映血管内皮功能，与血压变化密切相关［21-22］。血管内皮障碍是对炎症和氧化应激的血管反应，三者共同参与疾病的进展［23］。本研究结果显示，PIH模型大鼠血清ET-1和炎性因子TNF-α、IL-6水平及心肌、肾组织中脂质过氧化产物MDA含量显著升高，且血清NO水平和心肌、肾组织中抗氧化酶T-SOD活性显著降低，提示PIH大鼠心肌、肾组织发生氧化应激损伤，且体内存在炎症反应和血管内皮功能障碍。FMN治疗后，PIH大鼠血清ET-1和TNF-α、IL-6水平及心肌、肾组织中MDA含量显著降低，且血清NO水平和心肌、肾组织中T-SOD活性显著升高，提示FMN可显著改善PIH导致的心肌、肾组织氧化应激损伤及体内炎症反应和血管内皮功能障碍。

多项研究表明，JAK2/STAT3信号通路参与多种心、肾、肺等器官损伤相关疾病的发生发展，抑制JAK2/STAT3信号通路可减轻炎症和氧化应激，对机体组织发挥保护作用［24-26］。本研究结果显示，PIH模型大鼠心肌、肾组织中p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比值升高，提示PIH发生时，心肌、肾组织中JAK2/STAT3信号通路被激活；进一步分析发现，FMN治疗PIH大鼠可降低心肌、肾组织中p-JAK2、p-STAT3蛋白水平。JAK2抑制剂AG490对PIH大鼠的治疗效果与FMN一致，且FMN联合AG490对PIH大鼠血压和心肾损伤的改善作用均优于其单独治疗。这些结果表明，FMN可能通过抑制JAK2/STAT3信号通路降低血压，减轻PIH导致的心肌、肾组织损伤。Yu等［10］研究显示，FMN通过抑制JAK2/STAT3信号通路中的相关靶点，保护脑缺血再灌注损伤。

综上所述，FMN可能通过抑制JAK2/STAT3信号通路降低心肌、肾组织中氧化应激和全身炎症反应，改善血管内皮舒缩功能，降低血压，减轻PIH大鼠心肌、肾组织损伤，为FMN用于PIH治疗提供了实验依据。本研究仅初步观察了FMN对心肌、肾组织损伤的治疗作用，对胎盘、肝脏、脑等其他器官组织损伤和妊娠结局的影响有待进一步深入探讨。

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（收稿日期：2023-01-12）

（本文編辑薛妮）