固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法同时测定海产品中微囊藻毒素和鱼腥藻毒素

摘 要：目的：建立固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法同时测定海产品中7种微囊藻毒素和2种鱼腥藻毒素的方法。方法：样品经80%乙腈提取，HLB小柱净化后，采用MRM模式进行分析，外标法定量。结果：7种微囊藻毒素和2种鱼腥藻毒素在0.5～50.0 μg·L-1范围内线性关系良好，检出限为0.3 μg·kg-1，回收率为75.5%～98.8%，相对标准偏差在1.5%～5.4%。结论：该方法重现性较好、灵敏度高、成本低，可以实现海产品中的鱼腥藻毒素和微囊藻毒素的同时检测。

关键词：微囊藻毒素；鱼腥藻毒素；固相萃取（SPE）；高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）

Simultaneous Determination of Microcystins and Anatoxins in Marine Products by High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry with Solid Phase Extraction

LYU Xiaojing， JU Guangxiu， QU Xin， WANG Yong， YU Hongwei*

（1.Qingdao Municipal Center For Disease Control amp; Prevention/Qingdao Institute of Preventive Medicine， Qingdao 266033， China; 2.Shimadzu （China） Co.， Ltd.， Beijing Branch， Beijing 100020， China）

Abstract： Objective： A method for simultaneous determination of 7 microcystins （MCs） and 2 Anatoxins （AnTXs） in marine products was achieved by solid phase extraction （SPE）-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry （HPLC-MS/MS）. Method： The sample was extracted with 80% acetonitrile， purified by HLB small column， analyzed using MRM mode， and quantified using external standard method. Result： The linear ranges for 7 MCs and 2 AnTXs were 0.5～50.0 μg·L-1. The limits of detection were 0.3 μg·kg-1. The recoveries of the 7 MCs and 2 AnTXs spiked in blank marine products ranged from 75.5% to 98.8% with the relative deviations of 1.5%～5.4%. Conclusion： The method has the advantages of good reproducibility， high sensitivity and low cost， and can achieve simultaneous detection of fishy algae toxins and microcystins in seafood.

Keywords： microcystin; anatoxin; solid phase extraction （SPE）; high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （HPLC-MS/MS）

微囊藻毒素（Microcystins，MCs）和鱼腥藻毒素（Anatoxins，AnTXs）是两种典型的蓝细菌毒素[1]。微囊藻毒素是蓝藻释放的次级代谢产物，由环七肽和特殊的芳香族氨基酸侧链-AD-DA构成，100多种异构体中MC-RR、MC-LR最为常见。鉴于其毒性和危害，世界卫生组织在饮用水标准中规定了MC-LR的限值为1 μg·L-1，2017年被列入2B类致癌物清单[2]。鱼腥藻毒素是一类具有神经毒性的小分子生物碱，可造成神经传导阻滞[3]。此外，鱼腥藻毒素-A（Anatoxin-a，AnTX-a）与常见的微囊藻毒素MC-LR还会产生协同毒性作用[4-5]。

蓝细菌毒素通过各类水生生物特别是水产品进入食物链，最终进入人体内，从而对人类健康带来风险。青岛地区海产品食用量大，海产品安全关系到人们的健康。因此，建立快速、灵敏、准确的蓝细菌毒素检测方法，考察蓝细菌毒素在海产品中的含量及分布具有积极的意义。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

贝类和鱼类等海产品，购于青岛大型农贸市场和超市。

标准品（First Standard MC-LY：2.5 μg·mL-1；MC-LW：10 μg·mL-1；MC-YR：10 μg·mL-1；MC-LA：2.5 μg·mL-1；MC-LF：10 μg·mL-1；MC-RR：20 μg·mL-1；坛墨质检MC-LR：10 μg·mL-1；Eurofins Abraxis H-ATx：10 μg·mL-1；Canada ATX：5 μg·mL-1）。乙腈、甲酸均为色谱纯；实验用水为超纯水；Oasis HLB固相萃取小柱（60 mg，3 mL）。

岛津LC-MS/MS 8060液质联用仪；Milli-Q Gradient型超纯水器；手动固相萃取仪；氮吹仪。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的配制

各种微囊藻毒素和鱼腥藻毒素用甲醇配成50 ng·mL-1的标准储备液。再用标准储备液分别配成0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1、20.0 ng·mL-1和50.0 ng·mL-1的系列标准溶液，临用现配。

1.2.2 样品提取及净化

提取：将海产品（购于青岛大型农贸市场和超市）可食部分用组织捣碎匀浆机匀浆，取样品5 g置于50 mL离心管中，加入20 mL 80%乙腈溶液，涡旋混匀2 min，超声提取5 min，5 000 r·min-1离心5 min。取10 mL上清液待净化。

净化：按照Oasis HLB固相萃取小柱的操作条件，进行样品净化，将收集的洗脱液于40 ℃氮吹至近干，加入1.0 mL流动相初始比例复溶残渣，过0.22 μm滤膜，待上机。

1.2.3 色谱和质谱条件

（1）色谱条件。色谱柱Shim-pack Scepter C18-120；柱温：35 ℃；流速：0.35 mL·min-1；流动相组成：A-0.1%甲酸水溶液，B-乙腈；梯度洗脱：0～4 min，75%A→15%A；4～5 min，15%A；5～5.1 min，15%A→75%A。

（2）质谱条件。离子源：电喷雾离子源（ESI），正离子扫描；加热气流量：15 L·min-1；干燥气流量：3 L·min-1；雾化气流量：3 L·min-1；接口温度：350 ℃；脱溶剂管线DL温度：180 ℃；加热模块温度：400 ℃。扫描模式：多离子反应监测模式（Multiple Reaction Monitoring，MRM）。其他质谱参数见表1。

2 结果与分析

2.1 仪器条件优化

以乙腈与0.1%的甲酸水溶液作为流动相时目标物响应值最高，适量的甲酸有利于改善峰型且有助于提高离子化效率。分别考察ACQUITY UPLC BEH ® C18、Shim-pack GIST C18和Shim-pack Scepter C18-120 3种色谱柱的分离效果，发现用Shim-pack Scepter C18-120色谱柱时各化合物峰型较好且干扰较小。因此，实验选用Shim-pack Scepter C18-120色谱柱。

2.2 提取溶剂及超声时间的选择

结合文献报道[6]，考察了20%、40%、60%和80%的乙腈溶液的提取效率，结果显示，当乙腈为80%时，大部分化合物的相对较高，故选择80%乙腈溶液为提取溶剂。考察了超声时间为5 min、10 min、15 min和20 min的提取效率，结果表明，超声时间的延长，提取效率未见显著的提高，所以超声提取确定为5 min。

2.3 固相萃取柱的选择

文献报道显示[7]，C18固相萃取小柱容易受操作影响，从而导致回收率不稳定。实验中考察了HLB柱的提取效果，结果显示该柱能有效地对添加样品中的两类毒素进行富集和净化，故选择Oasis HLB固相萃取小柱。

2.4 标准曲线、检出限

配制一系列标准溶液，以目标物的峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标进行线性拟合，结果如表2所示。结果表明，在0.5～50.0 μg·L-1，9种蓝细菌毒素线性关系良好，相关系数均在0.99以上。以3倍信噪比确定各目标化合物的检出限为0.3 μg·kg-1，定量限为1.0 μg·kg-1。

2.5 回收率与精密度

在阴性样品花蛤中加入蓝细菌毒素混合标准溶液，分别进行0.8 μg·kg-1、4.0 μg·kg-1和20.0 μg·kg-1加标回收率考察，计算回收率及相对标准偏差。结果显示，加标回收率在75.5%～98.8%，相对标准偏差在1.5%～5.4%，精密度和准确度均较好。

2.6 实际样品的测定结果

购买100份海产品（贝类和鱼类各50份），按照本方法进行检测。结果显示，在一份花蛤样品中检出MC-YR，结果为0.83 μg·kg-1，在一份贻贝中检出MC-RR，结果为0.57 μg·kg-1，未有其他蓝细菌毒素的检出。

3 结论与讨论

本研究建立了SPE-HPLC-MS/MS方法分析海产品中蓝细菌毒素的方法，实现了鱼腥藻毒素和微囊藻毒素的同时测定。海产品经乙腈提取，HLB小柱净化，采用MRM测定，该方法灵敏度高，操作简单、快速，具有良好的精密度和准确度，可以为海产品中鱼腥藻毒素和微囊藻毒素等蓝细菌毒素的定性和定量检测提供技术参考。

参考文献

[1]王素钦，陶思依，宋立荣，等.高效液相色谱-二极管阵列检测法和超高效液相色谱-串联质谱法检测鱼腥藻毒素的比较研究[J].食品安全质量检测学报，2020，11（12）：3982-3991.

[2]World Health Organization.Guidelines for drinking-water quality， fourth edition[J].Asian Water： Asia’s Journal of Environmental Technology，2011，27（7）：34.

[3]CARMICHAEL W W， GORHAM P R.Anatoxins from clones of Anabaena flos-aquae isolated from lakes of western Canada[J].Sil Commun，1978，21（1）：285-295.

[4]CHIA M A，KRAMER B J，JANKOWIAK J G，

et al.The individual and combined effects of the cyanotoxins， anatoxin-a and microcystin-LR on the growth， toxin production and nitrogen fixation of prokaryotic and eukaryotic algae[J].Toxins，2019，11（1）：43.

[5]LI Q，GU P，ZHANG C，et al.Combined toxic effects of anatoxin-a and microcystin-LR on submerged macrophytes and biofilms[J].J Hazard Mater， 2020，389（5）：122053.

[6]徐潇颖，刘柱，毛思浩，等.全自动在线固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法测定螺旋藻中8种微囊藻毒素[J].食品科技，2023，48（4）：305-311.

[7]吴洁珊，倪清泉，任永霞，等.HPLC-高分辨飞行时间质谱测定水中多种微囊藻毒素[J].环境监测管理与技术，2020，32（6）：54-57.

作者简介：吕晓静（1982—），女，山东青岛人，硕士，主管技师。研究方向：理化检验。

通信作者：于红卫（1971—），女，山东青岛人，本科，副主任技师。研究方向：理化检验。E-mail：fish_yhw@126.com。