基于UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS的复方一枝蒿颗粒化学成分快速鉴定△

刘明娟，李凯琳a，张敏，唐苏女，刘玲，李晴，郭俐兰，杨建波，李辉*

1.湖南医药学院 药学院 侗医药研究湖南省重点实验室，湖南 怀化 418000；2.新疆维吾尔自治区药品检验研究院 国家药品监督管理局中药（维药）质量控制重点实验室，新疆 乌鲁木齐 830054；3.中国食品药品检定研究院，北京 100050

复方一枝蒿颗粒是维吾尔族医学中治疗感冒的临床经验方，由板蓝根、大青叶、一枝蒿3 味药组成[1]。板蓝根为菘蓝Isatis indigoticaFort.的干燥根，大青叶为菘蓝的干燥叶，一枝蒿为菊科蒿属多年生草本植物一枝蒿Artemisia rupestrisL.的全草，临床多用于抗病毒[2]。多项研究表明，板蓝根和大青叶主要成分包括氨基酸类、核苷类、多糖类、生物碱类、萜类、苯丙素类、有机酸类等成分，其中靛玉红是大青叶原药材含量控制成分，也属于大青叶特征性成分[3-4]；表告依春在板蓝根中含量稳定，属于其特征成分[5]。一枝蒿主要含有黄酮类、倍半萜类、生物碱类等化学成分[6]。复方一枝蒿颗粒主要有2 种制法，传统制粒为湿法制粒，将一枝蒿、大青叶、板蓝根3 味药加水煎煮滤过，浓缩醇沉，取上清液，回收乙醇并浓缩至稠膏，和辅料加入湿法制粒机制粒；改进制粒工艺采用喷雾制粒法，将一枝蒿、大青叶、板蓝根3 味药加水煎煮滤过，浓缩醇沉取上清液，回收乙醇并浓缩至清膏，和辅料加入喷雾制粒机容器仓制粒，改进制粒生产工艺更简单，颗粒成型良好[7]。

维吾尔族医学中记载复方一枝蒿颗粒功效为清除“乃孜来”、解毒利咽，用于治疗“乃孜来”所致的感冒、发烧、咽喉肿痛；中医记载其功效为解表祛风、凉血解毒，用于邪毒所致的感冒发热、咽喉肿痛，病毒性感冒见上述证候者[8]。现代研究证明，复方一枝蒿颗粒具有抗炎、抗病毒和免疫调节等功效，临床上主要用于治疗感冒发烧和咽喉肿痛，疗效确切[9-14]，但目前对复方一枝蒿颗粒成分研究报道较少。

超高效液相色谱-四极杆-静电轨道场离子阱质谱法（UHPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS）具有高分辨率高、高灵敏度、高分离度等特点，可同时快速分辨物质裂解的一级质谱和二级质谱信息，常被用于中药材及中药复方复杂化学成分的鉴定[15-18]。

本研究采用UHPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS 表征复方一枝蒿颗粒的化学成分，对各成分进行鉴定归属、系统分析，以期为复方一枝蒿颗粒的药效物质基础、质量控制等研究提供参考。

1 材料

1.1 仪器

Q-Exactive Focus 型四极杆-静电轨道场离子阱质谱仪、Dionex UltiMate 3000 型高效液相色谱仪均购于美国Thermo Fisher Scientific 公司；KQ-300DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Mighty-10 型超纯水机（上海砾鼎水处理设备有限公司）；AUW120D 型电子天平（福州华志科学仪器有限公司）；5424 R 型高速离心机（德国Eppendorf公司）。

1.2 试药

复方一枝蒿颗粒（新疆银朵兰药业股份有限公司，批号：220208、221226）。

对照品新绿原酸（批号：X-014-170309）、隐绿原酸（批号：Y-067-180425）、异绿原酸A（批号：Y-068-170903）、异绿原酸C（批号：Y-070-170515）、异绿原酸B（批号：Y-069-180105）、咖啡酸（批号：RDD-K00311812016）、异槲皮苷（批号：Y-076-181025）、木犀草素-7-O-葡萄糖苷（批号：M-025-181025）、木犀草素（批号：M-007-190422）、山柰酚（批号：S-014-171216）均购自成都瑞芬思生物科技有限公司；芦丁（成都埃法生物科技有限公司，批号：AF8032520）；山柰酚-3-O-新橙皮糖苷（武汉天植生物技术有限公司，批号：CFN201901）；蒙花苷（宝鸡市晨光生物科技有限公司，批号：HR16926S1）；芹菜素（成都普菲德生物技术有限公司，批号：22042001）；以上对照品纯度均大于98%；色谱纯甲酸、乙腈、甲醇购自天津康科德科技有限公司；水为纯净水（屈臣氏饮用水有限公司）。

2 方法

2.1 供试品溶液制备

精确称取复方一枝蒿颗粒2 g，移入100 mL 具塞锥形瓶中，加入70%甲醇50 mL，超声处理1 h后，将提取液抽滤得续滤液，在50 ℃旋干，取100 mg左右，加入甲醇1 mL溶解，在4 ℃、13 523×g离心20 min，取上清液置于进样小瓶中，即得供试品溶液。

2.2 对照品溶液制备

分别精密称取各对照品，加入甲醇溶解，配制成质量浓度为1 mg·mL-1的对照品溶液，再分别取50 μL 置于同一液相小瓶中，加入甲醇稀释至1 mL，摇匀，基于对照品不同的相对分子质量，将其制备成不同的混合对照品溶液（50 μg·mL-1），放于4 ℃保存，备用。

2.3 色谱条件

Thermo Scientific Syncronis C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相为0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～2 min，95%～92%A；2～5 min，92%～85%A；5～10 min，85%～78%A；10～12 min，78%～50%A；12～20 min，50%～35%A；20～25 min，35%～20%A；25～26 min，20%～95%A；26～30 min，95%A）；体积流量为0.3 mL·min-1；柱温为45 ℃；进样量为2 μL。

2.4 质谱条件

电喷雾离子源（ESI），正、负离子模式下采集，数据采用一级母离子全扫描和数据依赖性二级子离子扫描（Full Scan MS/dd-MS2）或平行反应监测模式（PRM）；Full Scan MS/dd-MS2参数设置：喷雾电压正离子模式下为3.5 kV、负离子模式下为3.0 kV；质谱扫描范围为m/z120～1000；分辨率为35 000；喷雾电压为3 kV；鞘气压力为30 arb；辅助气压力为10 arb；毛细管温度为320 ℃；S-lens 为50 eV，碰撞能量为30 eV。PRM 参数设置：分辨率为35 000，隔离窗口为m/z2.0，碰撞能量为50 eV，自动增益控制（AGC）设置为5.0×105。

2.5 化合物鉴定策略

建立基于UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS 鉴定中药成分化学成分的分析策略，进而开展复方一枝蒿颗粒的化学成分定性研究。1）根据中英文文献及网络数据库，检索复方一枝蒿颗粒及单味药材已报道的化学成分，建立该经典名方的化学成分数据库；2）通过Orbitrap 超高分辨率全扫描采集，根据一级质谱提供的精确相对分子质量，运用Xcalibur 4.2软件精确推测色谱峰的元素组成和分子式；3）将未知化合物的二级碎片离子与现有文献和已经建立的复方一枝蒿颗粒成分库对比，初步推测该色谱峰归属；对于具有相同元素组成和相似质谱碎片的同分异构体，考察其色谱保留时间，推测色谱峰可能的结构；4）归纳对照品和已确定的化学成分质谱裂解规律，不饱和度、N规律、同位素峰度规律等，推测未知化合物的类型和结构。

3 结果与分析

采用UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS对供试品溶液和对照品溶液进行分析，得到正、负离子模式下的总离子流图。通过分析准分子离子峰、碎片离子信息，结合对照品和文献报道，共鉴别了90 个化学成分，包括2个氨基酸、8个萜类、25个有机酸、11个含氮化合物、44个黄酮。其中，16个成分通过与对照品比对确认，见表1，其基峰离子色谱图见图1。

图1 复方一枝蒿颗粒正、负离子模式下的基峰离子色谱图

表1 复方一枝蒿颗粒中化学成分鉴定结果

3.2 氨基酸类成分

复方一枝蒿颗粒中鉴定出2个氨基酸成分（化合物1、3）。该类化合物在正离子模式下以准分子离子[M+H]+形式被检测出。化合物1的tR为2.42 min，正离子模式下准分子离子峰为m/z166.086 18 [M+H]+，预测分子式为C9H11NO2，MS2图谱中碎片离子主要有m/z149.059 7 [M+H-NH3]+、120.080 9 [M+HHCOOH]+和103.054 4 [M+H-HCOOH]+，与数据库基本一致，推断化合物1 为苯丙氨酸。化合物3 的tR为4.13 min，正离子模式下准分子离子峰为m/z205.096 89 [M+H]+，MS2图谱中碎片离子主要有m/z188.070 3 [M+H -NH3]+和146.059 8 [M+H -CHNO2]+，与文献[19]报道基本一致，推断化合物3为L-色氨酸。

3.3 萜类

倍半萜二聚体是新疆一枝蒿中极具特点的一类化合物，该类化合物在裂解时的主要特征是酯键断裂或环发生逆狄尔斯-阿德尔反应裂解（RDA）产生一枝蒿酮酸，进一步发生脱水、脱羧反应。从复方一枝蒿颗粒中共鉴定出8个萜类化合物（化合物65、70、79、81、86、88～90）。化合物90的tR为19.16 min，负离子模式下准分子离子峰为m/z479.280 27 [M-H]-，预测分子式为C30H40O5。MS2图谱中碎片离子主要有m/z435.290 9 [M-CO2-H]-、247.133 8 [M-HC15H30O3-H]-、231.138 7 [M-C15H30O3-OH-H]-，与文献[20]报道基本一致，推断该化合物为artepestrin E。化合物81负离子模式下的tR为14.23 min，准分子离子峰为m/z247.133 96，MS2图谱中碎片离子主要有m/z203.143 5 [M-CO2-H]-，188.120 1 [M-CO2-CH3-H]-，163.112 0 [M-C4H4O2-H]-，149.096 3[M-C2O3-C2H2-H]-，与文献[21]报道基本一致，推断该化合物为一枝蒿酮酸，可能的质谱裂解途径见图2。

图2 一枝蒿酮酸的裂解途径

3.4 有机酸类

有机酸是一类广泛存在于植物中的具有酸性的有机化合物，该类化合物在ESI 负离子模式下响应好，易失去H2O、CO2等中性碎片[22]。从复方一枝蒿颗粒中共鉴定出25 个有机酸类化合物（化合物2、5、7、12～16、18、19、21、23、27、30、32、34、43、51～53、57、66、67、69、71）。化合物5、12、13、16、51、52、57的tR分别为4.50、6.12、6.36、6.71、11.25、11.69、12.40 min，结合对照品的tR、高分辨质谱信息分别鉴定为新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、异绿原酸B、异绿原酸A 和异绿原酸C。隐绿原酸由1 分子的奎尼酸和1 分子的咖啡酸酯化生成，在负离子模式下准分子离子为m/z353.087 89 [M-H]-，二级碎片离子信息为m/z191.055 4、179.034 2、173.044 8、135.044 1，其裂解途径为酯键断裂得到奎尼酸碎片离子峰m/z191.055 4 [M-C9H6O3-H]-及咖啡酸碎片离子峰m/z179.034 2 [M-C7H10O5-H]-，奎尼酸继续脱去1 分子H2O 生成m/z173.044 8 [M-C9H6O3-H2O-H]-，而咖啡酸继续脱去CO2得到碎片离子m/z135.044 1[M-C7H10O5-CO2-H]-[23]。异绿原酸C 在负离子模式下准分子离子峰为m/z515.119 75 [M-H]-，预测分子式为C25H24O12。MS2图谱中碎片离子主要有m/z353.088 0 [M-caffeoyl-H]-、191.055 5 [M-2caffeoyl-H]-、179.034 2 [M-C7H10O5-H]-、173.044 7 [M-2caffeoyl-H2O-H]-，其可能的裂解途径见图3。

图3 异绿原酸C的裂解途径

3.5 含氮化合物类

从复方一枝蒿颗粒中共鉴定出11 个含氮化合物（化合物4、6、8～11、24、55、62、72、80）。化合物4的tR为2.42 min，正离子模式下准分子离子峰为m/z130.032 10 [M+H]+，预测分子式为C5H7NOS，MS2图谱中碎片离子主要有m/z84.044 9 [M-SCH2+H]+、70.065 8 [M-SC2H4+H]+，与文献[24]报道基本一致，推断该化合物为表告依春。化合物8 的tR为5.76 min，正离子模式下准分子离子峰为m/z217.097 08 [M+H]+，预测分子式为C12H12N2O2，MS2图谱中碎片离子主要有m/z144.080 7 [M-C4H11N+H]+和74.024 1 [M-C6H11N2O2+H]+，与文献[19]报道基本一致，推断该化合物为2,3-二氢-1H-吡咯并[2,1-C][1,4]苯并二氮杂卓-5,11(10H,1laH)-二酮。

3.6 黄酮类

黄酮类化合物是以2-苯基色原酮为骨架衍生的一类广泛存在于自然界的化合物，在ESI 电离条件下，黄酮类化合物易脱去H2O、CO 和CH2O 等中性碎片，黄酮的母核C 环易发生RDA 裂解反应，产生A环和B环特征碎片离子[22]。从复方一枝蒿颗粒中共鉴定出44 个黄酮类化合物（化合物17、20、22、25、26、28、29、31、33、35～42、44～50、54、56、58～61、63、64、68、73～78、82～85、87）。化合物36、41、45、47、73～75、77、78的tR分别为10.01、10.29、10.47、10.67、13.20、13.42、13.43、13.91、13.97 min，通过与对照品的tR、准分子离子和碎片离子比对，分别鉴定为芦丁、山柰酚-3-O-新橙皮苷、异槲皮苷、木犀草素-7-O-葡萄糖苷、蒙花苷、木犀草素、槲皮素、芹菜素、山柰酚。以化合物36芦丁的质谱裂解为例进行分析，见图4。芦丁为槲皮素的芸香糖苷，tR为10.01 min，预测分子式为C27H30O16，负离子模式下准分子离子峰m/z609.147 03[M-H]-，在丢失芸香糖中性碎片后形成苷元碎片m/z301.035 1 [M-Rha-Glc-H]-，苷元碎片发生RDA 裂解产生碎片m/z151.002 3、178.997 8[25]。化合物82正离子模式下的tR为14.43 min，准分子离子峰为m/z361.091 06 [M+H]+，预测分子式为C5H7NOS，MS2谱中碎片离子主要有m/z328.057 2[M-CH3-H2O+H]+、346.067 7 [M+H-CH3]+，与文献[26]报道基本一致，推断化合物82为猫眼草酚D。

图4 芦丁的裂解途径

4 讨论

中药复方中含有较为复杂的化学成分，明确化学成分组成对于阐明其药效物质基础、制定质量标准和进一步研究制备工艺具有重要意义[27]。新疆一枝蒿具有显著的清热解毒、消食健胃、利胆、解蛇毒、抗菌消炎、抗过敏作用，作为民族药，在民间应用已久。随着中药研究领域的扩大及中药制剂新技术的应用，新疆一枝蒿颗粒被广泛应用于临床[28]，但其复方制剂药效成分尚不明确，药理研究不够深入[29]。

本研究采用UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS 对复方一枝蒿颗粒的成分进行研究，通过获得的准分子离子峰、二级碎片离子峰，结合参考文献、数据库及对照品信息共鉴定出90 个化合物，以黄酮类、有机酸类和含氮类成分为主。已有研究表明，无特殊取代基的小分子黄酮类化合物（如木犀草素）可以较好地抑制新型冠状病毒主蛋白酶，发挥抗病毒作用[30]。现代药理学研究表明，黄酮类化合物具有抗炎、抗氧化、降血压、抗动脉粥样硬化、抗心肌缺血等药理作用[31-32]，有机酸类成分结构中的酚羟基具有易氧化的特点，使得这一类化合物均有不同程度的抗氧化、抗炎等药理作用[22]。这些可能是复方一枝蒿颗粒的主要的药效物质基础。本研究对复方一枝蒿颗粒的化学组成进行了较为系统的阐释，可为深入分析其药效物质基础及建立质量标准提供依据，也为进一步的药理作用机制研究提供了化学依据。

[利益冲突]本文不存在任何利益冲突。