妊娠期糖尿病对于子代新生儿B族链球菌感染免疫功能的影响研究

郑晨 朱莹雯 石娴静 张黛佳 沈秋萍

感染性疾病是新生儿期死亡的主要病因之一, 其中B 族链球菌(group B streptococcus, GBS)是临床最为常见的革兰阳性球菌之一, 同时也是引起新生儿败血症的主要病原体, 可导致肺炎、脑炎等严重感染, 甚至多器官功能衰竭。目前已证实与血糖正常的女性相比, 妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus, GDM)患者的外阴阴道感染率和阴道生态失调率更高［1］。流行病学证据表明, 在GDM 孕妇泌尿生殖器标本中分离出的最常见细菌是GBS, 北美孕妇中经菌落调整后的比例为21%～25%, 全球为18%［2］。因此, 孕母存在GDM 为其子代新生儿发生GBS 感染的高危因素之一［3］。目前GDM 已成为一个全球性的公共卫生问题。但目前对于新生儿存在GBS 感染时GDM 孕母对子代免疫功能的影响需更多研究。因此, 本研究通过将GBS 感染新生儿分为孕母GDM 新生儿感染组以及孕母非GDM 新生儿感染组, 另选同期单纯性高胆红素血症住院新生儿作为非感染对照组, 应用流式细胞术检测三组新生儿的外周血CD3+、CD4+、CD8+T 细胞计数以及CD4+/CD8+水 平, 炎 症 因 子IL-6、IL-10、IL-6/IL-10 以 及CD3-CD56+CD16+NK 细胞的水平。探讨GDM 孕母分娩新生儿在先天性感染的情况下其免疫系统变化以及意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择苏州大学附属常熟市第一人民医院新生儿科自2020 年12 月～2023 年3 月期间GBS感染的住院新生儿102 例, 其中细菌性肺炎新生儿50 例, 败血症新生儿52 例；将48 例母亲存在GDM的新生儿纳入孕母GDM 新生儿感染组, 其余54 例母亲孕期血糖监测正常的新生儿纳入孕母非GDM 新生儿感染组, 另选择同期住院单纯性高胆红素血症新生儿52 例为非感染对照组。三组新生儿均为足月产新生儿, Apgar 评分：1 min 评分均≥8 分, 5 min 评分均为10 分。三组间孕母年龄、新生儿性别、出生胎龄、出生体重、分娩方式比较, 差异均无统计学意义(P>0.05)；孕母GDM 新生儿感染组孕母体质量指数(BMI)高于孕母非GDM 新生儿感染组和非感染对照组, 差异存在统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 三组一般资料比较(n, ±s)

表1 三组一般资料比较(n, ±s)

注：与孕母GDM 新生儿感染组比较, aP<0.05

项目 孕母GDM 新生儿感染组(n=48) 孕母非GDM 新生儿感染组(n=54) 非感染对照组(n=52)新生儿性别(男/女) 25/23 28/26 27/25新生儿出生体重(g) 3885±503 3268±476 3503±417分娩方式(顺/剖) 32/16 37/17 40/12新生儿出生胎龄(周) 38.68±1.32 38.33±1.56 38.75±1.69孕母BMI(kg/m2) 25.17±4.52 18.23±2.51a 20.45±3.28a孕母年龄(岁) 33±5 32±7 31±6

1.2 纳入及排除标准 GBS 感染新生儿纳入标准：①新生儿早发型GBS 肺炎：生后出现气促、呻吟、吐沫、发绀、呼吸暂停等肺炎的临床表现, 影像学检查符合肺炎表现, 气管内分泌物或生后1 h 内胃液培养GBS阳性［4］；②新生儿早发型GBS 败血症［5］：存在败血症相关临床表现, 血液非特异性感染指标≥2 项阳性, 且血培养或无菌腔体内培养出GBS 病原体；③母亲孕期阴道分泌物GBS DNA 阳性。其中母亲孕期GDM 诊断符合2014 年《妊娠合并糖尿病诊治指南》［6］以及中华医学会后续发布的《妊娠期高血糖诊治指南(2022)》［7］。GBS 感染新生儿排除标准：①孕母孕前糖尿病者；②孕母孕前有免疫系统疾病及家族史；③孕母同时有其他妊娠期合并症及并发症者；④孕母孕周<37 周。非感染对照组纳入标准：新生儿血总胆红素以间接胆红素值升高为主, 无窒息、感染、肝功能异常, 胆红素水平未达换血指征, 非溶血性疾病所致黄疸, 新生儿TORCH 以及巨细胞病毒脱氧核糖核酸(CMV-DNA)检查阴性, 孕母孕期及围生期未患感染性疾病, 无不良孕产史、无基础疾病及慢性疾病(包括GDM), 无特殊药物使用史, 父母均无严重过敏性疾病, 无家族遗传性疾病史。本研究经常熟市第一人民医院伦理委员会审批,所有新生儿家属签署知情同意书。

1.3 研究方法 入组新生儿在入院 24～48 h 内用肝素钠抗凝负压真空采血管采取空腹静脉血2 ml, 在 4 h内对标本进行标记处理。采用流式细胞术(流式细胞 仪 器：安 捷 伦D2060R) 检 测CD3+、CD4+、CD8+、CD3-CD56+CD16+NK 细 胞 计 数(CD3+、CD4+、CD8+、CD56+、CD16+检测试剂：江苏鹿氏生物科技有限公司)、IL-6、IL-10 水平(细胞因子联合检测试剂盒：杭州赛基生物科技有限公司, 批号：JS-SOP-006)。

1.4 观察指标 比较三组新生儿免疫指标水平, 分析NK 细胞与淋巴细胞亚群的相关性。

1.5 统计学方法 采用SPSS26.0 进行统计分析。正态分布计量资料采用均数±标准差(±s)表示, 三组资料的比较采用单因素方差分析, 组间两两比较采用LSD-t 法；非正态分布资料采用中位数(第25 百分位数, 第75 百分位数)［M(P25, P75)］表示, 三组间比较采用Kruskal-Wallis 检验；相关性检验采用Pearson 检验。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组新生儿免疫指标水平比较 孕母GDM 新生儿感染组新生儿的CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、CD3-CD56+CD16+细胞计数均明显低于孕母非GDM 新生儿感染组和非感染对照组, 孕母非GDM 新生儿感染组低于非感染对照组, 差异有统计学意义(P<0.05)；孕母GDM 新生儿感染组新生儿的IL-6、IL-6/IL-10 水平均高于孕母非GDM 新生儿感染组, 孕母GDM 新生儿感染组和孕母非GDM 新生儿感染组新生儿的IL-6、IL-10 水平均高于非感染对照组, 孕母GDM 新生儿感染组新生儿的IL-6/IL-10 水平高于非感染对照组, 差异存在统计学意义(P<0.05)；孕母GDM 新生儿感染组和孕母非GDM 新生儿感染组新生儿的IL-10 水平比较差异无统计学意义(P>0.05)；孕母非GDM 新生儿感染组和非感染对照组新生儿的IL-6/IL-10 水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 三组新生儿免疫指标水平比较［ ±s, M(P25, P75)］

表2 三组新生儿免疫指标水平比较［ ±s, M(P25, P75)］

注：与孕母非GDM 新生儿感染组比较, aP<0.05；与非感染对照组比较, bP<0.05

项目 孕母GDM 新生儿感染组(n=48)孕母非GDM 新生儿感染组(n=54) 非感染对照组(n=52) F/H P CD3+细胞计数(个/μl) 2001±790ab 2495±559b 3635±833 14.914 <0.05 CD4+细胞计数(个/μl) 1380(1110, 1618)ab 1682(1460, 1917)b 2969(2017, 3286) 20.809 <0.05 CD8+细胞计数(个/μl) 546±214ab 651±281b 971±245 12.773 <0.05 CD4+/CD8+ 2.13±0.70ab 2.71±1.09b 3.44±0.73 9.070 <0.05 CD3-CD56+CD16+细胞计数(个/μl) 119±57ab 206±57b 399±56 93.603 <0.05 IL-6(pg/ml) 149.91(72.12, 478.37)ab 40.73(35.56, 78.89)b 6.98(4.52, 10.12) 37.432 <0.05 IL-10(pg/ml) 17.49(6.60, 21.79)b 10.34(5.73, 21.43)b 1.57(4.52, 10.12) 25.314 <0.05 IL-6/IL-10 13.98(7.43, 21.16)ab 3.96(3.41, 6.44) 3.50(2.84, 4.20) 33.113 <0.05

2.2 相关性分析 经Pearson 相关性分析, CD3-CD56+CD16+NK 细胞与CD3+、CD4+以及CD8+T 细胞呈正相关(r=0.588、0.580、0.461, P<0.05)。见表3。

表3 NK 细胞与淋巴细胞亚群的相关性分析

3 讨论

早发型GBS 感染的新生儿约90%在出生后12 h内进展为新生儿肺炎或败血症, 晚发型GBS 感染新生儿中约50%出现脑膜炎［8］。这种年龄特异性易感性原因可能与新生儿的免疫系统特点有关。研究表明, 孕期母体营养的失衡, 无论是缺乏还是过量, 都会对新生儿出生时的免疫力和生命早期的免疫成熟产生相当大的影响［9］。因此了解影响新生儿先天免疫系统的因素,尤其母体因素的影响, 对于制定产前干预以及产后康复策略至关重要。

本研究结果显示, 孕母GDM 新生儿感染组新生儿的CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、CD3-CD56+CD16+细胞计数均明显低于孕母非GDM 新生儿感染组和非感染对照组, 孕母非GDM 新生儿感染组低于非感染对照组, 差异有统计学意义(P<0.05)；提示在感染GBS情况时, GDM 孕母娩出新生儿的免疫功能有明显降低且存在细胞免疫调节紊乱情况。细胞因子方面：孕母GDM 新生儿感染组新生儿的IL-6、IL-6/IL-10 水平均高于孕母非GDM 新生儿感染组, 孕母GDM 新生儿感染组和孕母非GDM 新生儿感染组新生儿的IL-6、IL-10 水平均高于非感染对照组, 孕母GDM 新生儿感染组新生儿的IL-6/IL-10 水平高于非感染对照组, 差异存在统计学意义(P<0.05)；孕母GDM 新生儿感染组和孕母非GDM 新生儿感染组新生儿的IL-10 水平比较差异无统计学意义(P>0.05)；孕母非GDM 新生儿感染组和非感染对照组新生儿的IL-6/IL-10 水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。T 淋巴细胞亚群对维持机体细胞免疫功能相对稳定具有重要意义。CD3+是外周血成熟T 淋巴细胞的标记物, 其水平下降反映T细胞免疫功能降低。CD4+是辅助性T细胞、调节性T细胞的表面抗原, CD8+主要为细胞毒性T细胞亚群的表面抗原。在正常状态下, 初始CD8+T 细胞的启动是以高度可控的方式进行的, 主要是为了防止对正常健康组织产生反应, 前提是需要细胞内在和外在因素的混合物来正确扩增初始CD8+T 细胞并使其发挥功能, 在各种外源性因素中, CD4+T 细胞的帮助是形成初级CD8+T 细胞反应的关键。在CD4+T 细胞的帮助下, 在CD8+T 细胞内发生指导性编程防止肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)介导的CD8+T 淋巴细胞的活化, 从而诱导细胞死亡。因而在感染期间由于CD4+T 细胞的数量减少和功能缺陷可导致大量CD8+T 细胞反应受损［10］。CD4+/CD8+是评价机体免疫功能的主要指标之一［11］,感染新生儿的CD4+/CD8+较非感染对照组低, 提示感染新生儿细胞免疫功能受到抑制。本研究显示, 孕母GDM 新生儿感染组CD3+、CD4+以及CD4+/CD8+水平较非孕母GDM 新生儿感染组低, 差异存在统计学意义(P<0.05), 提示孕母患GDM 的子代新生儿当存在感染情况时T 细胞功能受到更明显的抑制, 且存在细胞免疫功能紊乱。韩国近年的文献显示［12］, 其国内母亲患有GDM 的新生儿败血症发病率明显高于母亲血糖监测正常组, 考虑如本研究所示GDM 孕母的子代免疫系统功能不全可能为致病原因之一。

一旦GBS 通过宿主细胞屏障进入血流或深部组织, 则需要机体启动固有免疫反应进行清除。NK 细胞是固有免疫应答中的关键细胞, 其主体为CD3-CD16+CD56+淋巴细胞, NK 细胞表面CD16 表达阳性率达90%, CD56 表达阳性率达95%, CD3 往往不表达［13］,其代表较成熟的NK 细胞, 杀伤功能强。在非致敏条件下即可产生细胞因子、趋化因子和溶细胞效应, 从而在感染和伤害暴露的早期快速调节免疫反应并直接参与宿主防御［14］。本研究中GBS 感染新生儿CD3-CD16+CD56+NK 细胞计数均低于非感染对照组(P<0.05),考虑为感染后NK 细胞消耗所致。孕母GDM 新生儿感染组CD3-CD16+CD56+NK 细胞计数低于非孕母GDM新生儿感染组, 两者差异存在统计学意义(P<0.05), 提示孕母存在GDM 的宫内环境对于娩出新生儿的固有免疫功能存在影响。既往有研究发现, 患GDM 的孕母脐血中CD3-CD16+CD56+NK 细胞明显减少, 考虑原因为患GDM 女性在妊娠期免疫平衡发生改变, 全身环境为促炎环境所致［15］。本研究与既往研究虽角度不同, 但结论一致。由此可以推论, 由于该类新生儿固有免疫功能低下会使得患GDM 的孕母娩出的新生儿对GBS更具有特殊的易感性。

本研究中, 与非感染对照组相比, GBS 感染新生儿的炎症细胞因子IL-6、IL-10 水平明显增高。其中孕母GDM 新生儿感染组新生儿的IL-6、IL-6/IL-10水平均高于孕母非GDM 新生儿感染组新生儿。IL-6是在炎症过程中产生大量的促炎细胞因子。IL-6 作为T 细胞活化的信号, 其诱导B 细胞分泌抗体和细胞毒性T 细胞分化, 参与全身炎症和自身免疫反应［16］。同时胎盘产生的高IL-6 可进入母体和胎儿循环［17］, 考虑此为孕母GDM 新生儿感染组新生儿IL-6 水平较非孕母GDM 感染组明显增高的原因。已知GDM 不仅是一种代谢性疾病, 也是一种低级炎症反应, 这种炎症性疾病普遍存在于血清、脂肪组织和胎盘中［18］。通过胎盘中物质的交换, GDM 孕母的胎儿在子宫内就经历了慢性的炎症过程, 使得GDM 母亲分娩的新生儿出现感染的风险增加［19］, 甚至发生胎儿炎症反应综合征(fetal infammatory response syndrome, FIRS)。而FIRS 的 特征即为胎儿血浆IL-6 浓度的升高［20］。此外, 产前炎症还可导致循环和肺部免疫细胞反应性降低［21］。本研究中GBS 感染新生儿IL-6 均明显高于非感染新生儿, 同时孕母GDM 新生儿感染组IL-6 水平明显高于非孕母GDM 新生儿感染组, 与以上相关文献结论相符。

IL-10 在预防脓毒症期间过度的促炎反应中发挥着重要作用［22］。IL-10 由不同类型的免疫系统细胞产生, 如单核细胞、巨噬细胞、T 和B 淋巴细胞以及NK细胞。研究表明, IL-10 的适当反应对全身炎症反应综合 征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)具有保护作用, 可以抑制促炎细胞因子产生［23］, 但另一方面高水平的IL-10 与儿童、成人败血症的不良预后相关。由于IL-6 和IL-10 在炎症过程中具有促进/耐受作用, 以控制通常的炎症反应, 因此两者之间的失衡可能导致过度炎症或免疫抑制［24］。

目前相关研究结果显示, 细菌感染后, 相比较其他细胞因子, IL-6 水平和IL-6/IL-10 水平对诊断新生儿败血症具有更高的敏感度和特异度［25］。IL-6/IL-10也可作为新生儿败血症有效抗菌治疗的标志物［25］。因此本研究选择上述指标进行分组分析, 结果显示孕母GDM 新生儿感染组IL-6/IL-10 明显高于孕母非GDM新生儿感染组以及非感染对照组, 提示孕母患GDM 的新生儿存在感染情况时出现更明显的促炎介质以及抗炎介质的失衡。已知这些炎症因子的产生和释放以及平衡失调会使得一开始具有抗感染保护作用的炎症反应转为损伤自身组织器官的过度炎症反应［26］, 激活的巨噬细胞过度释放介质可能会刺激多形核白细胞产生活性氧, 进而导致组织损伤和多器官衰竭, 进一步诱导新生儿脓毒症初期的全身炎症反应［27］, 因此更可能影响孕母患GDM 的新生儿感染的预后。既往的临床数据中发现, 并发新生儿坏死性小肠结肠炎(NEC)的新生儿感染病例IL-6/IL-10 比无并发症的病例平均水平高9.5 倍。这一结果也提示IL-6 水平的异常升高而没有IL-10 的调节可能是并发症的重要指标［28］。

本研究支持孕母患GDM 的情况会造成一系列新生儿免疫系统的损伤, 特别是在新生儿存在感染情况下。既往研究表明, NK 细胞与淋巴组织和非淋巴组织中的树突状细胞(dendritic cells, DC)之间存在密切的相互作用, 从而进一步对CD4+T 细胞和CD8+T 细胞应对感染的反应产生显著影响［29］。同时, 本研究探讨了CD3-CD16+CD56+NK细胞与CD3+、CD4+和CD8+的关系,结果为CD3-CD56+CD16+NK 细胞与CD3+、CD4+以及CD8+T 细胞呈正相关(r=0.588、0.580、0.461, P<0.05),也与上述文献结果相一致。因此免疫系统的损伤存在“一损俱损”的情况。

综上所述, GDM 不仅对孕妇本身有影响, 对其胎儿的宫内环境以及娩出后新生儿的免疫功能均在明显的影响, 新生儿的免疫功能受损直接影响新生儿感染性疾病的严重程度和预后, 因此, 防治GDM 对于防治新生儿感染也具有重要的意义；同时, 新生儿GBS 感染早期症状具有隐匿性, 因此及时对高危儿进行早期诊断、早期评估、早期治疗对于临床工作具有重要的意义。对于母亲患有GDM 的新生儿, 在临床工作中需注意免疫功能的监测, 对于明显免疫功能受损的新生儿, 必要时需进行更积极的支持治疗以及抗感染治疗。