小白杏生理落果中多酚提取及体外抗氧化活性分析

李硕 尼格尔热依·亚迪卡尔 朱金芳 冯作山 邓术升

doi：10.6048/j.issn.1001-4330.2024.03.012

摘  要：【目的】优化小白杏生理落果中多酚提取工艺，并研究其提取物抗氧化活性。为小白杏生理落果抗自由基氧化功能食品的开发与利用奠定基础。

【方法】以生理落果小白杏为原料，在单因素试验的基础上，采用响应面试验确定最佳工艺，并用分光光度法测定多酚提取物的体外抗氧化活性。

【结果】小白杏多酚的最佳提取工艺为提取时间34 min、提取温度60℃、液料比21∶1、乙醇浓度70%，小白杏生理落果多酚得率为12.50 mg/g。验证试验结果与预测值相对标准偏差为1.31%，回归模型适用于小白杏多酚的提取。小白杏多酚清除ABTS+、DPPH、O2-的IC50值分别为66.35、55.84和103.00 μg/mL，其清除自由基的能力由强到弱依次为DPPH、ABTS+、O2-；小白杏生理落果多酚对NO2-的清除能力较弱。

【结论】小白杏生理落果多酚能不同程度地清除ABTS+、DPPH、O2-、NO2-，具有一定的体外抗氧化活性，可用作抗自由基氧化功能食品的原料。

关键词：小白杏；生理落果；多酚；提取；响应面；抗氧化

中图分类号：S662.2    文献标志码：A    文章编号：1001-4330（2024）03-0623-09

收稿日期（Received）：

2023-07-15

基金项目：

新疆杏产业技术体系专项资金项目（XJCYTX-03-05-2021）

作者简介：

李硕（1996-），男，河北虞城人，硕士研究生，研究方向为食品营养与安全，（E-mail）ls9900@qq.com

通讯作者：

尼格尔热依·亚迪卡尔（1987-），女，新疆阿图什人，副教授，博士，硕士生导师，研究方向为药食两用植物功能性成分，（E-mail）nigary0115@sina.com

朱金芳（1976-），女，河南平頂山人，教授，博士，博士生导师，研究方向为食药用天然产物，（E-mail）zjf7619@126.com

0  引 言

【研究意义】小白杏（Armeniaca vulgaris Lam.）为蔷薇科杏属植物，在新疆各地均有栽培，其果实呈卵圆形，色泽浅黄，表面光洁无毛，甘味悠长，富含多种营养成分［1］，如多酚［2］、黄酮［3］、糖类［4］、有机酸［5］、胡萝卜素［6］、膳食纤维［7］等，果实成熟期在每年6月中下旬至7月中旬。小白杏可鲜食亦可用作加工，新疆杏加工产业链已初具规模，但高附加值、精深加工产品占比较低［8］。研究小白杏生理落果多酚提取，对其活性进行深度分析和挖掘及其创新功能产品开发有重要意义。【前人研究进展】近年来杏果实功能性成分逐渐受到关注，杏果实含有丰富的多酚，包括酚酸、黄酮醇以及黄烷醇等［9］，多酚是重要的天然抗氧化物质［10］，具有软化血管［11］、促进消化［12］、降血脂［13，14］、降血糖［15］、延缓衰老［16］，增强免疫力［17］，防止动脉硬化和血栓的形成［18］，抗疲劳［19］，抑制细菌［20-21］等。【本研究切入点】采用溶剂萃取法提取小白杏多酚，耗时长［22］，而溶剂回流提取法，具有耗时短，节省提取溶剂的优点［23］，且可以通过控制回流溶剂的浓度，使多酚富集。杏果实花后六到七周，贮藏养分不足，果实营养供应不良而产生生理落果［24］，生理落果口感酸涩，但多酚含量逐渐到达峰值［25］。【拟解决的关键问题】采用回流提取法对小白杏落果中多酚进行提取，测定小白杏多酚提取物体外抗氧化活性，为小白杏生理落果多酚功能性产品的开发提供理论依据和技术支撑。

1  材料与方法

1.1  材 料

小白杏生理落果于6月10日收集于吐鲁番市鄯善县达浪坎乡玉旺坎村。95%乙醇（天津鑫铂特化工有限公司）；亚硝酸钠、氯化铝、氢氧化钠、邻苯三酚、水杨酸、硫酸亚铁、过氧化氢、铁氰化钾、三氯化铁、三氯乙酸、碳酸钠、焦性没食子酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠（天津致远化学试剂有限公司）；DPPH、ABTS、过硫酸钾、福林酚、没食子酸对照品（纯度≥98%，批号：C111987277）（上海麦克林生化科技有限公司）；Tris-HCl溶液（上海源叶生物科技有限公司）；抗坏血酸（天津市森源化学试剂有限公司）。

T6型新世纪紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；RE-52HA型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；AL204-IC型电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；W201电热恒温水浴锅（上海申生科技有限公司）；TG16B型高速离心机（盐城市凯特实验仪器有限公司）。

1.2  方 法

1.2.1  多酚标准曲线的绘制

参考王竞珮［16］方法，绘制得到多酚标准曲线为Y=0.0394X+0.081，相关系数R2=0.999 3，没食子酸对照品溶液在4～12 μg/mL线性关系良好。

1.2.2  单因素实验筛选小白杏生理落果多酚提取工艺

取小白杏生理落果，放入榨汁机中制成匀浆，取1 g杏果实匀浆，精密称定，以多酚得率为考察指标，分别考察乙醇浓度（40%、50%、60%、70%、80%）、提取温度（30、40、50、60、70℃）、提取时间（20、30、40、50、60 min）、液料比（10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1）对小白杏生理落果多酚得率的影响。精密吸取适量提取液，于10 mL容量瓶中，分别加入0.5 mL福林酚，避光反应后，加入2 mL 75 g/L碳酸钠溶液，用蒸馏水定容，避光反应后，测定吸光度值。

小白杏多酚得率按公式（1）计算，试验平行3份，结果用±SD表示。

X=c×V×DW×1000×100%. （1）

式中，X-小白杏生理落果多酚得率（mg/g）；c-由直线回归方程求出的样品中总酚浓度（μg /mL）；V-提取液定容体积（mL）；W-杏果实质量（g）；D-稀释倍数。

1.2.3  响应面试验优化小白杏生理落果多酚提取工艺

以小白杏生理落果多酚得率为响应值，使用Design-Expert 8.0.6软件中Box-Behnken响应面分析法优化小白杏生理落果多酚回流提取工艺。表1

1.2.4  小白杏生理落果多酚体外抗氧化活性

1.2.4.1  小白杏生理落果多酚对ABTS+的清除率

参照肖默艳等［26］方法配置得到ABTS+工作液，将小白杏生理落果多酚提取液浓缩干燥后，将其配置成多酚浓度为30、60、90、120、150 μg/ml的溶液，取0.5 mL不同浓度的小白杏生理落果多酚溶液与2.5 mL ABTS+溶液，常温下避光反应20 min，选定波长为734 nm，测定样品吸光度值，以蒸馏水代替样品作为空白，按公式（2）计算清除率，试验平行3份，结果用±SD表示。

ABTS+·清除率=A0－（A1-A2）A0×100%.（2）

式中，A0-蒸馏水代替样品测得的吸光度； A1-样品加入到ABTS+工作液测得的吸光度； A2-无水乙醇代替ABTS+工作液测得的吸光度。

1.2.4.2  小白杏生理落果多酚对DPPH清除率

参照邢珂慧［27］等方法，将小白杏生理落果多酚提取液浓缩干燥后，将其配置成多酚浓度为30、60、90、120、150 μg/mL的溶液，在试管中加入2 mL不同浓度的小白杏生理落果多酚溶液，加入2 mL的0.1 mmol/L DPPH溶液（用无水乙醇配置），暗室中反应30 min，于517 nm下测定吸光度值，以蒸馏水代替样品作为空白，按公式（3）计算清除率，试验平行3份，结果用±SD表示。

DPPH·清除率=A0－（A1-A2）A0×100%.（3）

式中，A0-蒸馏水代替样品测得的吸光度；A1-样品加入到DPPH溶液测得的吸光度；A2-无水乙醇代替DPPH溶液测得的吸光度。

1.2.4.3  小白杏生理落果多酚对O2-清除率

参考杨秀东等［28］方法，将小白杏生理落果多酚提取液浓缩干燥后，将其配置成多酚浓度为30、60、90、120、150 μg/mL的溶液，取0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 8.2）4.5 mL，置于25℃水浴预热20 min，分别加入不同浓度的小白杏生理落果多酚1 mL 和25 mmol/L邻苯三酚溶液1 mL ，混匀后于25℃水浴反应5 min，剧烈振荡后立即在324 nm波长处检测吸光度值，每隔30 s测定1次，持续检测5 min，计算斜率值V；另外，以蒸馏水代替样品测定吸光度值A0，每隔30 s记录1次吸光度值，持续检测5 min，计算斜率V0，按公式（4）计算清除率，试验平行3份，结果用±SD表示。

O2-·清除率=V0-VV0×100%.（4）

式中，V0-蒸馏水代替样品得到的斜率；V-含样品体系得到的斜率。

1.2.4.4  小白杏生理落果多酚对NO2-清除率

参考康超等［29］方法，取5.0 mL 0.5 mol/L柠檬酸钠-盐酸缓冲液于50 mL容量瓶内，将小白杏生理落果多酚提取液浓缩干燥后，将其配置成多酚浓度为30、60、90、120、150 μg/mL的溶液，再分别加入5 mL不同浓度的小白杏生理落果多酚溶液，5 mL 10 μg/mL的NaNO2溶液。在37℃水浴下反应30 min，取出后立即加入2 mL 0.4%对氨基苯磺酸溶液，混匀，静置5 min后加入1 mL 0.2%盐酸萘乙二胺溶液，加水至刻度线，混匀，静置15 min，以蒸馏水代替样品作为空白，在波长为538 nm处测定吸光度值按公式（6）计算清除率，试验平行3份，结果用±SD表示。

NO2-·清除率=A0－（A1-A2）A0×100%.（5）

式中，A0-蒸馏水代替样品测得的吸光度；A1-样品加入到NO2-体系测得的吸光度；A2-蒸馏水代替NO2-体系测得的吸光度。

1.3  数据处理

数据用SPSS 26.0 软件计算，Design-Expert 8.0.6 软件进行响应面优化实验，GraphPad Prism 5.0计算IC50值，Origin 8.1绘制图片。

2  结果与分析

2.1  小白杏生理落果多酚提取工艺单因素比较

2.1.1  乙醇浓度对多酚得率的影响

研究表明，乙醇浓度在40%～70%，多酚得率呈上升趋势，乙醇浓度为70%时，多酚得率最高，随着乙醇浓度继续增加，多酚得率呈下降趋势，乙醇溶液中多酚更容易被溶解。选取70%乙醇为最佳提取溶剂。图1

2.1.2  提取温度对多酚得率的影响

研究表明，在温度为30～60℃，多酚得率随温度升高逐渐升高，之后温度继续升高，多酚不稳定，在高温下易分解，导致多酚得率下降，选择60℃为最佳提取温度。图2

2.1.3  提取时间对多酚得率的影响

研究表明，在提取时间为20～40 min时，多酚得率随提取时間延长而逐渐升高，随时间继续延长，多酚不稳定而分解，杂质成分溶出量增加，导致多酚得率下降，因此选择40 min为最佳提取时间。图3

2.1.4  液料比对多酚得率的影响

研究表明，液料比在10～25 mL/g，多酚得率缓慢上升，且液料比为25∶1时，多酚得率最大，但随着液料比增加，多酚得率呈下降趋势，同时液料比过高会造成乙醇的浪费，选择25∶1为最佳液料比。图4

2.2  小白杏生理落果多酚提取工艺响应面优化

2.2.1  响应面设计及结果

研究表明，模型差异极显著（P < 0.000 1），失拟项差异不显著（P = 0.068 3 > 0.05），模型的拟合度较好。提取时间对小白杏生理落果多酚提取率的影响最小，其中B、AD的影响显著（P < 0.05），C、AB、AC、BC、BD、CD、A2、B2、C2、D2的影响极显著（P < 0.01），最终获得的回归模型方程为Y=11.97 + 0.11A + 0.18B - 1.36C + 0.091D + 2.79AB + 2.82AC - 0.52AD - 1.39BC - 0.70BD - 0.45CD - 2.10A2 - 2.86B2 - 1.78C2 - 4.59D2 ，该回归模型的总决定系数 R2=0.9967，调整决定系数 R2Adj=0.993 5，该模型的拟合程度与稳定性均较好。表2～3

2.2.2  響应面的优化

研究表明，提取时间、液料比、乙醇浓度曲线弯曲程度最大，提取时间、液料比、乙醇浓度的交互作用最强。提取温度与液料比曲线最为平缓，提取温度与液料比曲线的交互作用最不明显。图5

2.2.3  模型验证

研究表明，小白杏生理落果多酚的最佳提取工艺参数为提取时间34 min、提取温度60℃、液料比21∶1、乙醇浓度70%。在此条件下，小白杏生理落果多酚得率为12.50 mg/g。采用上述优化提取工艺，提取小白杏生理落果多酚，实际测得的多酚得率为12.27 mg/g，与理论预测值相比，RSD=1.31<2%。响应面法用于小白杏生理落果多酚提取工艺优化是高效可行的。

2.3  小白杏生理落果多酚体外抗氧化活性

研究表明，小白杏落果提取物中多酚的浓度越高，对ABTS+、DPPH、O2-、NO2-的清除能力也越强，小白杏多酚清除ABTS+、DPPH、O2-的IC50值为63.55、55.84、103.00 μg/mL。小白杏落果提取物中多酚对 NO2-具有一定的清除作用，当多酚浓度到达90 μg/mL时，其 NO2-清除率达到最大值，为30.36%，其清除各种自由基的能力由强到弱依次为DPPH、ABTS+、O2-、NO2-。表4

3  讨 论

3.1

小白杏多酚具有油脂抗氧化［22］和体外抗氧化［30］作用，研究表明小白杏生理落果多酚抗氧化能力随浓度增加而增强，与王华磊等［30］研究结果一致。小白杏生理落果多酚清除ABTS+、DPPH、O-2的IC50值分别为63.55、55.84、103.00 μg/mL，李坪［31］研究了玫瑰花多酚的提取、分离纯化与生物活性，未纯化玫瑰花多酚清除ABTS+、DPPH的IC50分别为32.92、65.59 μg/mL，小白杏生理落果多酚清除DPPH能力比未纯化玫瑰花多酚强，清除ABTS+能力比未纯化玫瑰花多酚弱；孙晓波［32］研究了火麻籽粕多酚微波提取工艺与其抗氧化活性，火麻籽粕多酚清除O-2的IC50是100 μg/mL与小白杏生理落果多酚O-2清除能力相当；郭嘉凤［33］

研究了不同茶树鲜叶的体外抗氧化活性，其中‘云南群体鲜叶多酚浓度为150 μg/mL时，NO2-清除率约为50%，而相同浓度的小白杏多酚生理落果对NO2-的清除率为30.36%，其对NO2-清除能力弱于茶多酚。

3.2

氧化应激源于抗氧化物质和活性氧的生理失衡，机体中活性氧水平增加，耗尽抗氧化剂，最终导致氧化应激。氧化应激与多种疾病相关。试验研究表明小白杏生理落果多酚具有体外抗氧化活性，只有不同程度清除ABTS+、DPPH、O-2、NO2-的能力。

4  结 论

筛选出小白杏生理落果多酚的最佳提取工艺参数为提取时间34 min、提取温度60℃、液料比21∶1、乙醇浓度70%；小白杏生理落果多酚清除ABTS+、DPPH、O2-的IC50值分别为63.55、55.84、103.00 μg/mL，其清除各种自由基的能力由强到弱依次为DPPH、ABTS+、O2-；小白杏生理落果多酚对NO2-的清除能力较弱（浓度为150 μg/mL时，对NO2-清除率仅为30.36%），小白杏生理落果多酚能不同程度地清除ABTS+、DPPH、O2-、NO2-，具有一定的体外抗氧化活性，可用作抗自由基氧化功能食品的原料。

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Study on extraction and antioxidant activity of polyphenols from Armeniaca vulgaris Lam.during physiological fruit-falling period

LI Shuo1，Nigeerreyi Yadikaer1，2，ZHU Jinfang1，2，FENG Zuoshan1，2，DENG Shusheng1

（1. College of Food Sciences and Pharmacy，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830052，China; 2.Xinjiang Key Laboratory of Postharvest Science and Technology of Fruit，Urumqi 830052，China）

Abstract：【Objective】 In this study，the extraction process of polyphenols from Armeniaca vulgaris Lam.during physiological fruit-falling period was optimized and the antioxidant activity of the polyphenol extract was analyzed.

【Methods】  On the basis of single factor experiments，response surface method was used to determine the optimum process.The antioxidant activity in vitro was assayed with spectrophotometric method.

【Results】  the suitable extraction conditions were ethanol volume fraction 70%，solid-liquid ratio 1∶21，extraction time 34 minute and temperature 60℃.Under these conditions，the polyphenol extraction yield was 12.50 mg/g.The relative standard deviation of the proved experiment was 1.31% compared with the predicted value，which indicated the regression model was suitable for the polyphenol extraction from A.vulgaris.during physiological fruit-falling period.The IC50 of scavenging the free radicals of ABTS+，DPPH，O2-were 63.55，55.84，103.00 μg/mL respectively.The results indicated that the ability of the polyphenol extraction to scavenge free radicals in the order was DPPH>ABTS+>O2-.There is slightly lower scavenging ability of NO2- .

【Conclusion】 The findings would lays the foundation for the development and utilization of A.vulgaris.during physiological fruit-falling period in anti-free radical oxidation functional food.

Key words：Armeniaca vulgaris Lam.; green ripe stage;polyphenols; extraction; response surface；antioxidise

Fund project：Apricot Industrial Technology System Special Fund Project of Xinjiang Uygur Autonomous Region （XJCYTX-03-05-2021）

Correspondence author：Nigeerreyi Yadikaer（1987-）， female， from Artush， Xinjiang， ph.D， associate professor， Master's supervisor，research field： food nutrition and safety，（E-mail）nigary0115@sina.com

ZHU Jinfang （1976-）， female， from Pingdingshan， Henan， ph.D， professor， Doctoral supervisor，research field： study on natural products of food and medicine，（E-mail） zjf7619@126.com