不同粒径零价铁对微氧脱氮系统的影响

于雅楠，张潇，岳秀萍，2，赵博玮，周爱娟，崔颖，邢剑波

（1.太原理工大学环境科学与工程学院，山西晋中 030600； 2.山西浙大新材料与化工研究院，山西太原 030032； 3.大同市生态环境评估中心，山西大同 037002）

部分硝化反硝化厌氧氨氧化工艺（Simultaneous partial nitrification，ANAMMOX and denitrification，SNAD）〔1〕是在全程自养脱氮（Completely autotrophic nitrogen removal over nitrite，CANON）的基础上发展而来的微氧脱氮工艺。与CANON不同的是，SNAD工艺存在有机物，并非完全自养过程，其启动和运行的关键条件是控制反应器内溶解氧（DO）质量浓度为0.3~1.0 mg/L〔2-3〕，形成外层好氧内层缺氧或厌氧的微环境，从而实现部分硝化、反硝化以及厌氧氨氧化菌的共存。相较于传统的脱氮工艺，SNAD可以减少有机物的投加和曝气能耗。但微氧条件中，由于较低的溶解氧浓度有利于丝状菌生长，易引发污泥膨胀问题。因此在我国“碳达峰、碳中和”的政策背景下，如何高效低碳运行SNAD工艺具有重要的研究意义。

最近有大量研究证实，铁的加入可以促进厌氧氨氧化（ANAMMOX）的脱氮效率，促进厌氧氨氧化菌（Anaerobic ammonia oxidizing bacteria，AnAOB）富集〔4-7〕。铁是微生物重要的微量元素，微生物能量代谢中大量的铁硫蛋白、细胞色素均是以铁元素作为活性中心〔8-9〕。微生物胞外电子传递（EET）主要依赖位于外膜（OMCs）上的c型细胞色素〔10〕；铁可通过价态变化参与能量代谢中重要的电子传递过程〔11〕；还有研究发现一类以铁作为电子供体的自养反硝化菌〔12〕。此外，还有研究表明铁的加入可以促进氨氧化酶（Ammonia monooxygenase，AMO）和亚硝酸盐氧化还原酶（Nitrite oxidoreductase，NXR）的活性，并增加氨单加氧酶功能基因amoA的丰度〔13〕。这些研究大多采用厌氧或好氧的条件来探究零价铁（Zerovalent iron，ZVI）对单一功能菌群的影响，但很少有人探究微氧体系中ZVI对复杂群落的影响，因此，本研究从运行状况、微生物活性以及复杂群落中微生物演替3个方面进行分析，重点探究不同粒径ZVI介导下SNAD微氧系统的变化。

1 材料与方法

1.1 实验仪器及试剂

NH4Cl、C6H12O6、NaHCO3、KH2PO4、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、EDTA、H3BO3、MnCl2、CuSO4·5H2O、ZnSO4·7H2O、NaOH、NiCl2·6H2O、Na2WO4·10H2O、Na2MoO4·2H2O、KI、HgI、H2SO4、H3PO4、Ag2SO4、N-（1-萘基）-乙二胺盐酸盐、还原铁粉试剂购自国药集团，INT试剂购自麦克林试剂，以上药品均为分析纯。纳米铁粉试剂购自上海茂果纳米科技有限公司，COD相关测定试剂购自北京连华永兴科技发展有限公司，用于测定污泥EPS蛋白的BCA试剂盒购自上海生工。

表1 主要仪器设备Table 1 Main instruments and equipments

1.2 实验装置与运行条件

采用3个完全相同的由亚克力制作而成的外曝气回流微氧污泥床反应器，分别命名为R1、R2和R3，长30 cm、宽10 cm、高12 cm、有效容积为3.6 L，如图1所示。

图1 工艺流程示意Fig.1 Technological flow chart

反应器出水通过充分曝气至溶解氧为5.0~6.0 mg/L，部分富氧水回流到反应器内保证反应器内DO维持在0.2~0.5 mg/L。反应器内温度控制在（30±1） ℃，水力停留时间（HRT）设置为12 h。反应器内的接种污泥来自实验室运行5个月的升流式微氧反应器R0，MLSS=8.718 g/L，MLVSS=4.377 g/L。反应器进水使用实验室配制的TN为70 mg/L，COD/TN为3的模拟废水，分别向3个反应器中投入平均粒径为50 nm、200 nm和微米级别的ZVI（50 nZVI、200 nZVI和mZVI）对污泥进行驯化，投加量均为每4天投入120 mg。实验共持续25 d，每天对反应器出水中的污染物进行检测，对接种污泥和运行结束后污泥的胞外聚合物（Extracellular polymeric substances，EPS）、电子传递活性（Electron transport system activity，ETSA）、微生物酶活性和群落组成进行检测。

模拟污水由以下物质组成：NH4Cl（267.5 mg/L）、C6H12O6（196.88 mg/L）、NaHCO3（1 000 mg/L）、KH2PO4（22 mg/L）、CaCl2·2H2O（20 mg/L）、MgSO4·7H2O（300 mg/L）和每升1.2 mL矿物质溶液。

矿物质溶液的组成：EDTA（15 g/L）、H3BO3（0.014 g/L）、MnCl2（0.99 g/L）、CuSO4·5H2O（0.25 g/L）、ZnSO4·7H2O（0.45 g/L）、NiCl2·6H2O（0.19 g/L）、Na2WO4·10H2O（0.21 g/L）、Na2MoO4·2H2O（0.22 g/L）。

1.3 分析方法

反应器出水经过0.45 µm滤头过滤后立即对水中NH4+-N、NO2--N、NO3--N和COD进行检测。NH4+-N、NO2--N和NO3--N分别采用纳氏试剂分光光度法（λ=420 nm）、N-（1-萘基）-乙二胺二盐酸盐分光光度法（λ=540 nm）和麝香草酚分光光度法（λ=415 nm）测定，总无机氮（Total inorganic nitrogen，TIN）为3种无机氮（NH4+-N、NO2--N、NO3--N）之和。COD采用连华科技多功能水质检测仪检测。出水中Fe质量浓度采用原子吸收光谱法测量。

EPS采用热提取法〔14〕提取出溶解型胞外聚合物（Soluble extracellular polymeric substances，S-EPS）、松散结合型胞外聚合物（Loosely bound extracellular polymeric substances，LB-EPS）和紧密结合型胞外聚合物（Tightly bound extracellular polymeric substances，TB-EPS）。使用苯酚-硫酸法和上海生工BCA蛋白分析试剂盒分析EPS中的多糖（Polysaccharide，PS）与蛋白（Protein，PN）含量。用三维荧光光谱仪（RF-6000，日本岛津）检测EPS的3D荧光光谱（3DEEM）。

粗酶液的提取与酶活性检测参照文献〔15〕的检测方法进行。采用INT法检测污泥的ETSA〔16〕。

1.4 高通量测序

接种污泥和经过50 nZVI、200 nZVI、mZVI驯化25 d的污泥分别命名为S0、S1、S2和S3。用引物338F（5’-ACTCCTACGGGGGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）对16S rRNA基因水平进行PCR扩增。用Illumina MiSeq（美吉生物）对其进行高通量测序，并使用美吉生信云平台（www.majorbio.com）进行数据分析。

2 结果与讨论

2.1 反应器运行情况分析

分别考察不添加ZVI、50 nZVI、200 nZVI、mZVI驯化条件下反应器进出水NH4+-N、NO2--N、NO3--N和COD的变化，结果见图2。

图2 不同粒径ZVI驯化条件下反应器出水变化Fig.2 Variation of reactor effluent under ZVI domestication with different particle sizes

图2（a）和图2（e）为接种污泥反应器（RO）出水各参数变化情况。在不投加ZVI的条件下出水TIN约为15.643 mg/L，总无机氮去除率（RE-TIN）约为77.726%。COD去除率约89.449%。由图2（b）~图2（d）中各反应器的RE-TIN可知，在SNAD系统中加入ZVI后均有一个RE-TIN下降的适应阶段，投加50 nZVI的反应器在投加7 d后，RE-TIN开始上升，而投加200 nZVI和mZVI的反应器分别在投加后的第3天和第4天RE-TIN开始上升，到第7 天开始有小幅度下降。3个反应器的RE-TIN均在运行17 d后趋于稳定，分别为83.591%、80.800%和80.689%。NH4+-N为出水中TIN的主要形态，故NH4+-N去除效率与RE-TIN有一样的变化趋势。在ZVI的介导下，3个反应器均出现了NO2--N积累现象，但不同的是，投加50 nZVI的反应器在前8天出水NO2--N高于NO3--N，投加200 nZVI的反应器在前5天出水NO2--N高于NO3--N，而投加mZVI的反应器仅在第2天出现此现象。这可能是由于亚硝酸盐氧化菌（Nitrite oxidizing bacteria，NOB）对于ZVI的敏感度较氨氧化菌（Ammonia oxidizing bacteria，AOB）更低，粒径更小的ZVI对AOB的刺激作用更加明显。NO2--N的积累也是ZVI影响下的正常现象，此前有研究发现单位质量土壤中包含10 mg/g的nZVI抑制了NH4+-N氧化电位，并伴有NO2--N产生〔17〕。NO2--N的积累为AnAOB的富集提供底物，运行中NO2--N的变化情况使得投加nZVI的反应器中AnAOB丰度更高。

图2（f）~图2（h）所示为3个投加ZVI反应器中COD去除效果。图中数据表明，在投入ZVI后3个反应器出水COD均呈现先下降后上升最终趋于平稳的变化趋势。3个反应器均在第6天达到最高的COD去除率，分别为87.323%、87.831%和90.052%。从第7天起COD去除率有小幅度下降，直到第17天后趋于稳定，3个反应器的COD去除率分别稳定在78.802%、80.671%和83.535%。COD的数据变化表明，添加ZVI对COD的去除产生抑制作用，ZVI粒径越小，对COD去除的抑制作用越强。文献〔18〕报道nZVI对很多好氧异养微生物的抑制作用明显，而好氧异养微生物是微氧活性污泥体系中去除COD的主要功能菌群。

Fe为一种活泼金属，会被水中溶解氧腐蚀，在微氧活性污泥系统中，ZVI还会被污泥中的微生物腐蚀，溶出更多的铁离子，也会影响系统中pH的变化。考察了不同粒径ZVI条件下，各反应器出水Fe质量浓度及pH的变化，结果见图3。

图3 反应器出水Fe质量浓度（a）与pH（b）变化Fig.3 Changes of Fe mass concentration （a） and pH （b）of the reactor effluent

由图3（a）可以看出，在反应器运行前10天，出水中Fe质量浓度由高到低依次是R1、R2、R3，平均质量浓度分别为0.930、0.823、0.556 mg/L，粒径越小的ZVI介导系统出水中Fe质量浓度越高。但在运行10 d后，出水中Fe平均质量浓度由高到低依次为R2、R1、R3，分别为1.267、0.998、0.482 mg/L。这可能是由于粒径越小的Fe，其相对表面积越大，越容易被氧化为离子状态，故前10天出水中Fe质量浓度表现出R1>R2>R3。运行10 d后，出水中Fe质量浓度表现出R2>R1>R3，这种现象的产生一方面50 nZVI粒径小，更容易被EPS吸附，故而产生的铁离子更容易被微生物利用，从而使得出水中检测到的铁质量浓度居中；另一方面50 nZVI粒径最小，最有可能被微生物吸收到细胞周质空间被氧化利用〔19〕，从而导致随反应器出水流出的铁质量浓度低。

图3（b）为3个反应器进水与出水pH的变化，进水pH在7.69±0.49，R1~R3反应器出水pH分别为7.87±0.46、7.92±0.37和8.01±0.39。硝化作用消耗碱度，反硝化过程产生碱度，出水pH整体相较于进水pH增大，说明在反应器中反硝化仍是脱氮的主要途径。而根据3个反应器出水pH的对比可以看出，随着投加ZVI粒径的增大，出水pH也随之增大，这也表明在nZVI介导的反应器中消耗碱度的硝化过程更加活跃。部分硝化过程能够产生更多的NO2--N，AnAOB的反应底物增加有利于其富集，这可能也是出水pH较低的R1和R2中检测到高丰度的AnAOB的原因。

2.2 微生物胞外聚合物及活性分析

2.2.1 微生物胞外聚合物分析

EPS是微生物的保护性屏障，是细胞之间合作和交流的介质〔20〕，主要由PN和PS构成。接种污泥及R1~R3反应器中污泥的EPS中PN和PS质量分数见图4。

图4 EPS中PN、PS变化Fig.4 Changes of PN and PS in EPS

由图4可知，4个污泥样品的EPS中PN的质量分数都明显高于PS质量分数。S1~S3中单位质量VSS包含PN质量由接种污泥S0的36.266 mg/g分别增加到44.193、40.495、40.982 mg/g。已有研究表明，在金属离子的影响下，微生物会产生更多的蛋白质，与金属形成络合物从而降低金属离子的毒性，保护微生物免受金属离子的伤害〔21〕。50 nZVI介导的污泥（S1）中PN的增加量明显高于另外两个污泥，这表明小粒径的ZVI更容易被EPS吸附，对微生物的影响更加显著。S1~S3中单位质量VSS包含PS的含量由接种污泥S0的13.669 mg/g分别增加为15.261、15.512、15.293 mg/g。3个污泥样品的EPS中PS的质量分数并未有较大的差距，说明ZVI粒径对EPS中PS的影响不大，故m（PN）/m（PS）的不同主要是由m（PN）影响，3个污泥中的m（PN）/m（PS）由接种污泥的2.653分别变为2.896、2.611和2.680。数值的增加表明EPS中PN含量更高，PN主要构成EPS中的疏水部分〔22〕，PN含量高的污泥稳定性更强，投加50 nZVI的反应器中m（PN）/m（PS）高于另外两个反应器，这表明50 nZVI对微生物EPS的作用更显著，促使污泥更加稳定。总体来说，50 nZVI更容易被EPS吸附，促进EPS产生，同时提高污泥的稳定性。

3D-EEM是研究EPS组分的重要手段之一，根据激发（Ex）/发射（Em）波长的范围分别将其划分为5个区域，分别对应5类有机物（表2），图5是4个污泥样品中不同类型EPS的3D-EEM。

图5 EPS的3D-EEMFig.5 3D-EEM of EPS

表2 荧光物质分区Table 2 Fluorescent substance partition

由图5可以看出，在5类有机物中，各类型EPS中酪氨酸与色氨酸这两种芳香蛋白的荧光强度最强，芳香蛋白类物质在保持污泥絮体结构稳定方面发挥重要作用〔23〕。S-EPS中富里酸和腐殖酸的荧光强度明显高于其他EPS。

由图5中4个样品的荧光强度对比可以发现，在加入ZVI后，各类型EPS的主要荧光物质并未发生明显变化，但荧光强度有明显增强。ZVI的介导促进了EPS的产生，尤其是区域Ⅰ和Ⅱ代表的两类芳香蛋白，在3层EPS中都有最强的荧光响应。同时在对EPS中的PN和PS含量检测中也发现ZVI介导的EPS中PN的含量明显升高，区域Ⅰ的酪氨酸蛋白物质是污泥团聚的物质基础；区域Ⅲ所代表的富里酸类物质主要存在于S-EPS中，ZVI的介导使得富里酸的荧光响应强度有一定的降低；区域Ⅳ代表的腐殖酸类物质主要存在于LB-EPS和TB-EPS中；区域Ⅴ代表的溶解性有机物主要存在于S-EPS和LBEPS中，其中，LB-EPS层中两类有机物的荧光响应强度增加最为明显。腐殖酸能够与环境中金属、有机物等发生一系列氧化还原反应，与金属还原、有机物分解具有密切的联系〔24-26〕。

2.2.2 微生物活性分析

为了考察不同粒径ZVI驯化下污泥中微生物活性的变化情况，对接种污泥、S1~S3共4个污泥样品进行了脱氮酶的活性（以单位时间转化单位质量蛋白质的酶量计）和微生物ETSA（以单位时间单位质量TSS还原的INT计）的变化分析，结果见图6。

图6 反应器中污泥活性变化Fig.6 Change of sludge activity in reactor

由图6（a）可知，在加入ZVI后，除硝酸盐还原酶（Nitrate reductase，NR）以外，其余3种脱氮酶活性均有明显提高，尤其是氨氧化酶（Ammonia monooxygenase，AMO）与亚硝酸盐氧化酶（Nitrite oxidoreductase，NOR），这与文献中报道的这两种硝化酶均含有以铁作为关键元素的活性中心〔27〕相符。从3个反应器4类酶活性的对比可以看出，mZVI对酶活性的促进效果更加显著，单位时间单位质量蛋白中AMO、NOR、亚硝酸盐还原酶（Nitrite reductase，NIR）分别为9.099、3.839、2.138 µg/（mg·min），分别为初始酶活性的5.513、7.860、2.727倍。AMO的活性随着投加ZVI粒径的增加而增加，这可能是由于小粒径的ZVI促进了AnAOB的富集，厌氧氨氧化成为氨氧化脱氮的主要途径。而NOR和NIR的活性在50 nZVI和mZVI的介导下均有比200 nZVI介导下更强的活性。

由图6（b）可知，加入不同粒径ZVI的S1、S2和S3中检测出的ETSA相较于接种污泥S0有明显增加。并且50 nZVI驯化的S1中电子传递活性明显更高，是S0的1.48倍。S2和S3几乎持平，分别为S0的1.16和1.15倍，这表明粒径更小的ZVI对电子传递活性的促进作用更加明显。ZVI对ETSA的影响在于，电子传递过程（ETS）中包含很多以铁元素为活性中心的蛋白如铁硫蛋白、细胞色素等〔11〕。细胞色素大都位于电子传递链的后端，其主要功能就是电子传递。细胞色素按其吸收光谱和氧化还原电位的差别可分成多种类型，如cyt.a，cyt.a3，cyt.b，cyt.c等。它们都以血红素作为辅基，且血红素通过其分子中心铁的价态变化来传递电子生成能量〔28〕，所以铁在电子传递中充当着载体的重要作用。 外加ZVI可通过EPS的吸附、价态间的转化等一系列途径，使得部分铁进入细胞成为微生物形成血红素与铁硫蛋白的重要原料，而粒径越小的ZVI便更加容易被微生物吸附、利用，这也是50 nZVI系统中ETSA最高的原因所在。

2.3 污泥群落分析

2.3.1 微生物群落多样性分析

活性污泥中微生物的种类越多，说明其微生物网络越复杂，废水的处理效能越稳定。通过Alpha多样性分析对接种污泥及S1~S3中微生物多样性进行表征，结果见表3。

表3 Alpha 多样性指数Table 3 Alpha diversity index

由表3可知，4个样本的Coverage值均在0.99以上，说明测序结果能够可靠的表示样品性质。表示种群生态优势的指数Sobs在S0、S1和S2中相差不大，而S3的Sobs指数低于其他3个样品，这表明S3中物种数量分布更加均匀，同时也说明优势菌种的地位不突出。评估物种总数的Ace指数和Chao指数表明随着ZVI粒径的减小，物种总数在增加，但低于接种污泥。Shannon指数和Simpson指数都表明S1中微生物群落多样性更高。

2.3.2 微生物群落组成

对系统中微生物种类进行高通量测序，门水平微生物群落组成见图7。

图7 门水平微生物群落组成Fig.7 Microbial community composition at the phylum level

由图7可以看出，门水平上，Proteobacteria在4个样品中均为优势菌门，其丰度分别为29.042%、26.483%、30.811%和37.181%。Proteobacteria是大部分硝化菌和反硝化菌所属的菌门〔29〕。Chloroflexi为仅次于Proteobacteria的微生物菌门，在4个样品中丰度分别为22.427%、25.001%、20.051%和18.475%，Chloroflexi中多为兼性厌氧微生物，常存在于污泥菌胶团絮状体内部，能够起到充当骨架的作用，且此菌门中包含很多参与碳、氮、硫循环的微生物〔30〕。Chloroflexi相对丰度在S1中最大，在S3中最小，可以推测出粒径小的ZVI更加能够促进菌胶团及各类循环的微生物的稳定性。AnAOB主要存在的菌门Planctomycetota的相对丰度从接种污泥的2.867%分别变为5.628%、4.729%和1.057%。这表明小粒径的ZVI对于AnAOB的富集有明显的促进作用。

为了对系统中的功能微生物进行细致分析，对系统中脱氮微生物进行统计。主要对脱氮密切相关的AOB、NOB、AnAOB、自养反硝化菌（Autotrophic denitrifying bacteria，ADNB）、异养反硝化菌（Heterotrophic denitrifying bacteria，HDNB）在属水平上的变化进行对比分析，结果见图8。

图8 属水平脱氮微生物组成（a）及不同功能菌群的丰度（b）Fig.8 Composition of denitrifying microorganism at the genus level（a） and abundance of different functional groups （b）

在4个样品中均只检测出Nitrosomonas这一种AOB，丰度分别为0.127%、0.100%、0.196%和0.102%，加入ZVI的污泥与接种污泥差距不大。微氧状态导致好氧菌AOB不会大量富集，AnAOB的富集进一步丰富了NH4+-N的去除途径。Nitrospira作为一种适合在低营养条件下生长的NOB〔31〕，也是样品中唯一被检测出的NOB，在4个样品中的相对丰度分别为0.102%、0.040%、0.112%和0.127%。ZVI投加粒径的增加，NOB相对丰度随之增加，使得系统中NO2--N的浓度降低。NOB与AnAOB产生底物竞争关系，从而影响AnAOB的富集。

AnAOB作为SNAD系统中主要的功能微生物之一，其丰度也是SNAD系统启动成功运行稳定的重要参考指数，接种污泥来自运行5个月的SNAD系统，含有2.717%的AnAOB，分别是相对丰度为2.438%的Candidatus_Brocadia和0.279%的Candidatus_Kuenenia。在经过3种不同粒径ZVI的介导驯化后，Candidatus_Brocadia的相对丰度变为4.650%、4.189%和0.782%，Candidatus_Kuenenia丰度变为0.692%、0.378%和0.088%。AnAOB在加入纳米级的ZVI驯化后得到较好富集，这也是AOB丰度不高但NH4+-N去除率仍很高的原因。同时，从两种AnAOB的相对丰度数据中可以看出，50 nZVI对AnAOB的富集促进作用更加显著，而投加mZVI的污泥样品中AnAOB丰度却低于接种污泥样品。这种现象的产生一方面由于S3中NOB丰度较高，与AnAOB产生底物竞争；另一方面，nZVI更容易被EPS吸附，从而被微生物利用。

样品中还检测出Hydrogenophaga（丰度分别为1.560%、1.592%、1.564%和1.832%）、Thiobacillus（丰度分别为0.404%、0.432%、0.411%和0.285%）、Microbacterium（丰度分别为0.171%、0.104%、0.157%和0.373%）3种ADNB，以及Tessaracoccus（丰度分别为0.755%、1.164%、0.806%和1.206%）和Thauera（丰度分别为0.221%、0.558%、0.495%和0.424%）两种兼性自养反硝化微生物。从对不同功能菌丰度的统计中可以看出，在加入ZVI后，ADNB的丰度有轻微的上升，由接种污泥中的1.964%，分别增加到2.024%、1.975%和2.117%。由此可见，mZVI对ADNB的富集促进作用更加显著。

同时样品中还存在多种HDNB，相对丰度较高的主要是Gemmobacter、Denitratisoma和Azospira。Azospira具有固氮和反硝化功能，并且是可以在厌氧条件下依赖NO3-的Fe（Ⅱ）氧化剂〔32〕。在S1、S2和S3样品中还检测到丰度分别为0.558%、0.305%和1.011%的Ignavibacterium，明显高于S0中丰度（0.089%），有研究表明其与AnAOB存在很强的合作关系〔33〕，Ignavibacterium中存在与铁有关的铁铵氧化菌〔34〕。

基于对微生物群落结构的分析，在加入nZVI后，AnAOB大量富集对脱氮起重要作用，而mZVI的影响下，系统中起到主要脱氮作用的是HDNB。

通过美吉生信云平台采用Spearman方法对ZVI介导驯化后S1、S2和S3中脱氮微生物与高丰度的异养微生物进行相关性计算。图9（a）为微生物相关性网络，其中绿色线连接表示两个物种呈现负相关，红色线连接表示两类微生物呈现正相关，不同的物种颜色表示微生物所属的不同门类水平，不同物种节点的大小表示其在群落中的丰度大小；图9（b）为微生物相关性热图，二者结合可以直观地表现出物种之间的关系网络。

图9 丰度前30微生物相关性网络（a）和丰度前30微生物相关性热图（b）Fig.9 Correlations network of the top 30 microbial in abundance （a）， and heat map of correlations among the top 30 microbial in abundance （b）

由图9可以看出，微氧系统中重要的AnAOB与各种HDNB和ADNB之间显示出复杂的网络关系，组成系统中脱氮的主要途径。系统中检测到的两种AnAOB（Candidatus_Brocadia和Candidatus_Kuenenia）与HDNB的Gemmobacter、Denitratisoma、Thauera和norank_f_Comamonadaceae呈正相关，HDNB能够利用系统中的有机物去除厌氧氨氧化反应产生的硝态氮，补充除厌氧氨氧化脱氮过程；与ADNB的Hydrogenophaga和Microbacterium均呈负相关，分析其原因在于Hydrogenophaga是以氢为电子供体的ADNB，而AnAOB适宜在偏碱性环境中生存；有报道称Microbacterium为铁机制的自养反硝化菌〔35〕，其与AnAOB可能会产生对铁机制的竞争作用。AnAOB与SBR1031中的norank_f_A4b和norank_o_SBR1031正相关，SBR1031是异养菌属，能够利用各种有机小分子，能将氨转化为硝酸盐〔36〕。上述分析表明，在ZVI介导下的SNAD系统中ANAMMOX和异养反硝化的共同作用是脱氮的主要途径。

2.3.3 群落功能预测分析

从微生物氧需求、生物膜形成以及革兰氏性质对4个污泥样品中的微生物功能进行分析，并进行BugBase表型预测，结果见图10。

图10 物种表型贡献Fig.10 Phenotypic contribution of species

经过ZVI介导驯化后，污泥中好氧型菌属整体丰度减少，但具有反硝化基因的好氧菌Thermus〔37〕丰度增加，尤其是50 nZVI介导的S1中。厌氧型菌属在两种尺寸nZVI介导下丰度增加，而在mZVI的介导下，厌氧型菌属丰度减少，厌氧型菌属丰度的变化主要是由AnAOB中Candidatus_Brocadia和Candidatus_Kuenenia的变化造成。兼性厌氧型菌属在ZVI介导驯化后丰度增加，且与ZVI粒径呈现出正相关，其中Gemmobacter和norank_ f_Comamonadaceae两种兼性厌氧反硝化菌增加最明显。对菌群氧需求的分析表明，ZVI的介导会抑制好氧菌的生长，但mZVI能够促进菌群中兼性厌氧菌的生长，nZVI能够促进厌氧菌的生长。

生物膜形成菌属在nZVI介导下丰度减少，主要变化在于unclassified_ f_Enterobacteriaceae和Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium丰度减少；而在mZVI介导下生物膜形成菌属丰度增加，主要变化在于Gemmobacter丰度增加。但前面EPS的数据表明，在ZVI介导下，微生物EPS不论是含量还是荧光强度都有所增加，分析产生这种现象的原因可能是nZVI抑制了一部分生物膜形成微生物的生长，但同时促进了另一部分生物膜形成菌的生长与活性，比如Gemmobacter在ZVI介导下丰度增长明显。

活性污泥大部分微生物属于革兰氏阴性菌，在ZVI的介导下，革兰氏阳性菌丰度减少，阴性菌丰度增加，且ZVI粒径越小，这种介导作用就越明显。

图11为4个污泥样品中微生物FAPROTAX功能预测热图。

图11 FAPROTAX功能预测热图Fig.11 FAPROTAX functional prediction heat map

由图11可以看出，在检测到的50种功能细菌群落中，与氮代谢相关的菌群主要包括氮呼吸型（Nitrogen_respiration）、硝酸盐还原型（Nitrate_reduction）、硝酸盐呼吸型（Nitrate_respiration）、亚硝酸盐呼吸型（Nitrite_respiration）、厌氧氨氧化型（Anammox）、氮固定型（Nitrogen_fixation）、硝酸盐反硝化型（Nitrate_denitrification）、亚硝酸盐反硝化型（Nitrite_denitrification）、氧化亚氮反硝化型（Nitrous_oxide denitrification）、反硝化型（Denitrification）10种类型。氮呼吸型、硝酸盐还原型、硝酸盐呼吸型、亚硝酸盐呼吸型、厌氧氨氧化型为主要的氮代谢菌群。氮呼吸型、硝酸盐还原型、硝酸盐呼吸型菌群在ZVI介导下丰度增加，且硝酸盐还原型、硝酸盐呼吸型菌群的丰度随着ZVI粒径的增大而增大，在mZVI介导的S3中硝酸盐还原与硝酸盐呼吸菌群丰度最大。亚硝酸盐呼吸型和厌氧氨氧化型菌群在两种粒径的nZVI介导下丰度增加，在mZVI介导下丰度减少。以上分析与微生物物种组成中与BugBase表型预测的变化现象相符合。

3 结论

1）nZVI对TIN的去除效率影响较大，nZVI能够显著促进NO2--N的积累，更好地为AnAOB的富集提供底物条件。

2）通过对EPS含量的定量分析与3D-EEM的定性分析发现，ZVI对微生物EPS的产生有促进作用，其中50 nZVI更容易被EPS吸附，并在其促进下单位质量VSS中PN达到了44.193 mg/g，更有利于促进生物膜形成菌属的活性，提高污泥絮体的稳定性。

3）与铁元素密切相关的AMO和NOR酶活性在ZVI影响下均有明显提升，其中mZVI对其促进作用较nZVI影响更加显著，经mZVI驯化的污泥中AMO和NOR酶活性分别是接种污泥的5.513倍和7.860倍。电子传递活性在50 nZVI的促进下增长为接种污泥的1.484倍，明显高于粒径更大的ZVI的促进作用。

4）不同粒径的ZVI对AnAOB的富集作用有不同程度的影响，在nZVI影响下Candidatus_Brocadia和Candidatus_Kuenenia两种AnAOB的丰度分别从接种污泥中的2.438%和0.279%最高增长到4.650%和0.692%。

5）ZVI介导会促进对氧需求不敏感的微生物的富集，不同的是nZVI介导的SNAD系统中更容易形成由以Candidatus_Brocadia为代表的厌氧氨氧化与以Gemmobacter和norank_ f_Comamonadaceae为代表的兼性厌氧反硝化的共同脱氮过程。而mZVI介导下兼性厌氧反硝化为系统中的主要脱氮过程。