白藜芦醇腹腔注射对神经管畸形大鼠胚胎脊髓组织中线粒体生物发生及细胞凋亡的影响

赵璐，张雅琳，刘竹溪

中国医科大学附属盛京医院重大慢性病精准医学协同创新重点实验室，沈阳 110004

神经管畸形（neural tube defects， NTDs）如脊柱裂、脑膨出、无脑畸形等，是由于胚胎神经管闭合障碍引起的一类中枢神经系统先天畸形，其中脊柱裂最常见，可导致婴儿严重残疾甚至死亡，给患儿及其家庭以及社会都带来沉重的负担［1-2］。研究［3］显示，胚胎发育过程中神经管无法闭合是导致NTDs的直接原因，而细胞凋亡是NTDs的发生机制之一。线粒体是重要的生物能量和信号传导中枢，线粒体生物发生对于维持线粒体的生物能量功能非常重要，是神经系统疾病发病机制的核心［4］。线粒体生物发生是指通过增加线粒体内酶的表达及活性进而形成新的线粒体的复杂过程，是一种线粒体自我更新的途径［5］，其调节因子包括沉默调节蛋白1（silent mating type information regulation 2 homolog-1， SIRT1）、氧化物酶体增殖物激活的受体γ共激活因子1α（peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1 alpha， PGC-1α）及其下游线粒体转录因子A（mitochondrial transcription factor A， TFAM）等。研究［6］显示，SIRT1广泛参与代谢控制和线粒体的生物发生，是线粒体生物发生的关键调节因子。研究［7］显示，转录因子EB（transcription factor EB，TFEB）也可以对线粒体生物起源相关基因（如Ppargc1α和Ppar1α）的表达发挥一定的调节作用。研究［8］发现，在NTDs中，神经管闭合失败与神经上皮细胞过度凋亡有关，其中的抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax参与调控细胞凋亡并发挥重要作用。全反式维甲酸（all-trans retinoic acid， atRA）是维甲酸的衍生物，可作为一种致畸剂影响神经系统的发育。研究［9］发现，对于怀孕的哺乳动物，过量atRA可以引起后代各种NTDs的发生。白藜芦醇（resveratrol， RSV）是一种天然植物多酚，在植物中分布广，在细胞的生物学功能中具有重要作用［14］，也被确定为SIRT1激活剂［10］。有报道［11-12］称，RSV可预防糖尿病引起的胚胎畸形，减少胚胎发育不良，RSV还可通过激活SIRT1发挥对抗细胞凋亡的作用。2021年5月9日—2023年10月30日，我们观察了RSV腹腔注射对NTDs模型大鼠胚胎脊髓组织中线粒体生物发生调节因子及细胞凋亡相关蛋白的影响，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 NTDs模型大鼠制备、分组及RSV给予方法30只雌性Wistar大鼠和10只雄性Wistar大鼠购自北京华阜康生物技术有限公司，饲养于中国医科大学附属盛京医院SPF级实验动物房。雌鼠随机分为对照组、致畸组和RSV组，每组10只。雌雄（比例为3∶1）合笼，第二天清晨阴道涂片，发现有精子定为胚胎第0天（记为E0）。AtRA（140 mg/kg）购自美国Sigma-Aldrich公司，溶于橄榄油后，在E10给予致畸组和RSV组孕鼠一次灌胃处理，对照组孕鼠注入等量橄榄油。RSV（40 mg/kg）购自美国MedChemExpress公司，溶于50%生理盐水、5% DMSO、5% Tween80和40% PEG400中，从E8至E17每天腹腔注射一次，对照组给予同体积的溶剂腹膜内注射。在E18时，剖宫产取出大鼠胚胎，在体视显微镜下观察并分离新鲜未经固定脊髓组织，立即快速冷冻，并在-80 ℃下储存。

1.2 各组大鼠胚胎脊髓组织中线粒体生物发生标志物SIRT1、TFEB、PGC-1α、TFAM检测

1.2.1 各组大鼠胚胎脊髓组织中线粒体生物发生标志物SIRT1、TFEB、PGC-1α、TFAM mRNA检测采用实时荧光定量PCR法。取各组大鼠胚胎脊髓组织，使用TRIzol提取总RNA，用核酸蛋白测定测定样品的OD260值及OD260/OD280比值，计算RNA总浓度及纯度。依照TaKaRa逆转录试剂盒操作方法将RNA逆转录为cDNA。参照TaKaRa公司的试剂盒说明书，进行实时荧光定量PCR反应。扩增条件为95 ℃、2 min，95 ℃、5 s，60 ℃、32 s，共40个循环。引物序列如下：SIRT1正向引物为5′-TGTTTCCTGTGGGATACCTGA-3′，反向引物为5′-TGAAGAATGGTCTTGGGTCTTT-3′；TFEB正向引物为5′-GCGGTCACTGAAGGACAGAG-3′，反向引物为5′-GCAGCAAACTTGTTGCCGTA-3′；PGC-1α正向引物为5′-CACCGTAAATCTGCGGGATG-3′，反向引物为5′-TATCCATTCTCAAGAGCAGCGAAAG-3′；GAPDH正向引物为5′-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3′，反向引物为5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3′。以2-ΔΔCt法表示组织中目的mRNA的相对表达量。

1.2.2 各组大鼠胚胎脊髓组织中线粒体生物发生标志物SIRT1、TFEB、PGC-1α、TFAM蛋白检测 采用Western blotting法。取各组大鼠胚胎脊髓组织，研磨匀浆后蛋白裂解，BCA法检测总蛋白浓度。取40 μg总蛋白进行SDS-PAGE电泳，将凝胶转至甲醇激活过的PVDF膜。用5%脱脂奶粉封闭2 h，TBST清洗。加入一抗（SIRT1抗体1：1000稀释，购自美国Cell Signaling Technology公司；TFEB抗体1∶1000稀释，购自中国Proteintech公司；PGC1α抗体1∶1000稀释，购自中国Proteintech公司；TFAM抗体1∶1000稀释，购自中国Proteintech公司；β-actin抗体1∶5000稀释，购自中国Proteintech公司），4 ℃摇床孵育过夜。TBST清洗3次，加入相应二抗水平摇床室温孵育1 h，TBST清洗3次，ECL显色。Image J图像分析软件对条带进行定量分析比较，以目标蛋白灰度值/内参蛋白灰度值表示目的蛋白的相对表达量。

1.3 各组大鼠胚胎脊髓组织中凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax检测 采用Western blotting法。检测方法参照1.2.2，其中Bcl-2抗体1∶1000稀释，购自美国Cell Signaling Technology公司；Bax抗体1∶1000稀释，购自美国Cell Signaling Technology公司；β-actin抗体1∶5000稀释，购自中国Proteintech公司。

1.4 统计学方法 采用SPSS16.0统计软件。计量资料正态性检验采用 Shapiro-Wilk 检验，符合正态分布的计量资料以±s表示，组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠胚胎脊髓组织中线粒体生物发生标志物SIRT1、TFEB、PGC-1α、TFAM表达比较

2.1.1 各组大鼠胚胎脊髓组织中线粒体生物发生标志物SIRT1、TFEB、PGC-1α、TFAM mRNA相对表达量比较 对照组大鼠胚胎脊髓组织中SIRT1、TFEB、PGC-1α、TFAM mRNA相对表达量分别为1.01 ± 0.13、1.01 ± 0.13、1.02 ± 0.24、1.03 ±0.25，致畸组大鼠胚胎脊髓组织中SIRT1、TFEB、PGC-1α、TFAM mRNA相对表达量分别为0.82 ±0.08、0.71 ± 0.08、0.86 ± 0.14、0.69 ± 0.17，其中致畸组SIRT1、TFEB、TFAM mRNA相对表达量均低于对照组（P均＜0.05）；RSV组大鼠胚胎脊髓组织中SIRT1、TFEB、PGC-1α、TFAM mRNA相对表达量分别为1.10 ± 0.21、1.90 ± 0.21、1.22 ± 0.37、2.36 ±0.30，相对表达量均高于致畸组（P均＜0.05）。

2.1.2 各组大鼠胚胎脊髓组织中线粒体生物发生标志物SIRT1、TFEB、PGC-1α、TFAM蛋白相对表达量比较 对照组大鼠胚胎脊髓组织中SIRT1、TFEB、PGC-1α、TFAM蛋白相对表达量为1.00 ±0.18、1.00 ± 0.21、1.00 ± 0.12、1.00 ± 0.12，致畸组大鼠胚胎脊髓组织中SIRT1、TFEB、PGC-1α、TFAM蛋白相对表达量为0.62 ± 0.19、0.57 ± 0.24、0.65 ± 0.24、0.75 ± 0.13，两组相比，P均＜0.05；RSV组大鼠胚胎脊髓组织中SIRT1、TFEB、PGC-1α、TFAM蛋白相对表达量为1.10 ± 0.12、1.04 ± 0.12、1.41 ± 0.13和1.14 ± 0.18，两组相比，P均＜0.05。

2.2 各组大鼠胚胎脊髓组织中凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax相对表达量比较 对照组大鼠胚胎脊髓组织中Bcl-2、Bax蛋白相对表达量为1.00 ± 0.14、0.99 ±0.19，致畸组大鼠胚胎脊髓组织中Bcl-2、Bax蛋白相对表达量为0.56 ± 0.03、1.50 ± 0.32，两组相比P均＜0.05；RSV组大鼠胚胎脊髓组织中Bcl-2、Bax蛋白相对表达量为0.78 ± 0.18、1.13 ± 0.24，其中RSV组Bcl-2蛋白相对表达量高于致畸组（P＜0.05）。

3 讨论

尽管在NTDs的机制和治疗方面取得了进展，但目前的研究仍然有限。本研究提供了证据，在atRA诱导的大鼠NTDs模型中，RSV可上调线粒体生物发生相关蛋白的表达，挽救凋亡相关蛋白的表达。这些结果强调了RSV通过靶向激活SIRT1，参与了NTDs中线粒体生物发生以及凋亡的调节。

RSV是一种天然的植物多酚，在植物中分布广，含量较高。RSV是SIRT1的一种有效激活剂，在细胞的生物学功能中具有及其重要的的作用［13］。有报道［11-12］称，RSV可预防糖尿病引起的胚胎畸形，减少胚胎发育不良。在神经发育过程中，维持线粒体网络的健康和功能至关重要［14］。我们先前的研究［15］表明，在atRA诱导的NTDs大鼠中，RSV处理增强了线粒体自噬，并在一定程度降低了NTDs发生率。线粒体是决定神经干细胞命运的关键调节细胞器，无论是在初始神经发育还是在成年神经发生中［16］。线粒体生物发生对于维持线粒体的生物能量功能非常重要。研究［6，17］表明，SIRT1可广泛参与代谢控制和线粒体的生物发生，其通过靶向PGC-1α而成为线粒体生物发生的关键调节因子。PGC-1α是线粒体生物发生和呼吸的主要调节因子，PGC-1α基因缺失小鼠的组织表现出线粒体基因表达减少、线粒体呼吸减少和线粒体功能受损［18］。已有研究［19-20］表明，在母体糖尿病诱导的胚胎NTDs模型中，PGC-1α的表达被抑制。PGC-1α通过上调TFAM以启动线粒体DNA转录增加线粒体生物发生，维持细胞存活［21-22］。TFAM是一种被证明可以调节体内线粒体DNA拷贝数的哺乳动物蛋白质，TFAM和线粒体DNA之间的相互作用参与线粒体生物发生的调节［23］。

本研究中使用atRA造模，诱导NTDs大鼠胚胎模型。研究结果显示，相比于对照组，atRA致畸组大鼠胚胎脊髓组织中SIRT1、TFEB、TFAM mRNA相对表达量显著降低，以及SIRT1、TFEB、PGC-1α和TFAM的蛋白相对表达量均显著降低。通过RSV给药后，能显著性升高atRA致畸组大鼠胚胎脊髓组织中SIRT1、PGC-1α、TFAM mRNA相对表达量以及蛋白相对表达量。此外，我们还发现给予RSV处理后，胚胎脊髓中TFEB mRNA相对表达量和蛋白相对表达量都显著上调。TFEB属于螺旋—环—螺旋亮氨酸拉链（bHLH-LZ）转录因子MiTF/TFE家族成员，已被证明是自噬和溶酶体生物发生的关键转录调控因子。不仅如此，研究［24］发现TFEB对PGC-1α的表达也具有一定的影响。由此，RSV增强了TFEB和PGC-1α/TFAM通路，从而逆转了atRA诱导的NTDs大鼠胚胎脊髓组织中线粒体生物发生功能障碍。

在NTDs中，神经管闭合失败与神经上皮细胞过度凋亡有关，其中的抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax参与调控线粒体途径细胞凋亡并发挥重要作用［8］。研究［25］显示，RSV可通过激活SIRT1发挥对抗细胞凋亡的有益特性。本研究中，我们观察到相比于对照组，在atRA诱导的NTDs模型大鼠胚胎脊髓组织中，Bcl-2蛋白相对表达量显著下调，Bax蛋白相对表达量显著上调。通过RSV给药后，相比于atRA致畸组，Bcl-2蛋白相对表达量显著上调，说明RSV可一定程度减轻NTDs大鼠胚胎模型中脊髓组织的凋亡。

综上所述，RSV能够恢复atRA诱导NTDs大鼠胚胎线粒体生物发生相关蛋白表达，逆转NTDs中凋亡相关蛋白的表达。这些结果提示，作为一种天然的特异性SIRT1激活剂，RSV对NTDs动物模型具有一定保护作用。然而关于RSV生物利用度及母胎安全性的问题尚不明确，有待于进一步研究论证。