3-甲基腺嘌呤对转化生长因子-β诱导大鼠肝脏星形细胞株HSC-T6活化及自噬的影响观察

惠瑜，安红梅，窦岚，曹可

新疆第二医学院公共卫生学院预防医学教研室，新疆 克拉玛依 834000

肝纤维化是一种伤口愈合反应，是由于持续的肝损伤和炎症反应导致细胞外基质（Extracellular matrix， ECM）不断积累［1］，可干扰正常肝功能，最终发展为肝硬化甚至肝癌。在反复的肝损伤过程中，肝脏星状细胞（Hepatic Stellate Cell， HSC）被激活，促进了肝纤维化的发生发展［2］。因此，预防HSC活化被认为是抗纤维化治疗的关键策略［3］。近期的研究［4］表明，自噬可促进造血干细胞的激活和肝纤维化的形成。自噬是新发现的参与HSC活化和肝纤维化进程的一种机制，它通过输送甘油三酯等组分为HSC的活化提供能量。研究［5］显示，随着自噬水平的升高，HSC被激活。3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine，3-MA）是最常用的自噬抑制剂之一，可通过抑制Ⅲ型磷脂酰肌醇3-激酶（PI-3K）来阻断自噬［6］，但是3-MA在HSC活化中的作用尚未确定。2023年3—8月，我们观察了3-MA对转化生长因子-β（TGF-β）诱导的大鼠肝脏星形细胞株HSC-T6活化及自噬的影响，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞、仪器和试剂 大鼠肝脏星形细胞株HSC-T6细胞购自中国科学院上海细胞库，具有短串联重复序列鉴定报告。超净工作台购自苏州智净净化公司，CO2恒温培养箱购自美国赛默飞公司，倒置荧光显微镜购自德国徕卡公司，研磨仪购自武汉赛维尔生物科技有限公司，纯水仪购自重庆艾科浦公司，冷冻离心机购自中国heal force公司，电泳仪购自北京六一公司，荧光定量PDR仪购自美国赛默飞公司，紫外分光光度计购自上海现科仪器有限公司，逆转录仪购自美国赛洛捷克公司，脱色摇床、电泳仪购自北京六一仪器厂，DMEM高糖培养基购自美国Hyclone公司，胎牛血清购自中国赛默飞世尔科技有限公司，TRIzol购自中国索莱宝科技有限公司，氯仿、异丙醇、无水乙醇购自国药集团药业股份有限公司，RIPA裂解液、磷酸化蛋白酶抑制剂、BCA蛋白定量检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，LC3、Beclin-1、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、TGF-β1、Atg-5抗体购自美国Jackson公司。

1.2 细胞培养 将冻存的HSC-T6细胞从液氮罐中取出后，移至37 ℃水浴锅中，使细胞在1 min内迅速融化。待冻存液完全融化后，将细胞悬液吸至离心管中，加入2 mL完全培养基，400 g离心5 min，弃上清，细胞重新悬浮于1 mL培养基中，转移至培养瓶中，加入4 mL完全培养基，置于37 ℃、5% CO2的培养箱内培养。细胞隔两天换一次液，待细胞生长融合度达到80%左右，使用1 mL 0.25%胰酶消化收集细胞，按照1∶2进行传代培养，收集生长状况良好且处于对数生长期的细胞进行后续实验。

1.3 细胞分组及3-MA给予 取生长状况良好且处于对数生长期的HSC-T6细胞分为空白组、TGF-β+PBS组、TGF-β+3-MA组。TGF-β+3-MA组细胞加入浓度为2 ng/mL TGF-β培养72 h后加入3-MA（0.5 mg/mL）处理24 h，TGF-β+PBS组细胞加入浓度为2 ng/mL TGF-β培养72 h后加入等量PBS处理24 h，空白组加入等量PBS处理。

1.4 各组细胞活化标志物α-SMA、TGF-β检测

1.4.1 各组细胞活化标志物α-SMA、TGF-β mRNA检测 采用实时荧光定量PCR法。取各组细胞，TRIzol法提取总RNA，经纯度及完整性鉴定后反转录生成cDNA。以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR检测，引物序列如下：α-SMA上游引物5′-GGATCAGCGCCTTCAGTTCT-3′，下游引物5′-AGGGCTAGAAGGGTAGCACA-3′；TGF-β上游引物为5′-AGTGCTGAGGAGAAACCGTG-3′，下游引物5′-TTTGTGCATCGGCTGAAAGC-3′；内参基因GAPDH上游引物5′-ACTCTACCCACGGCAAGTTC-3′，下游引物5′-TGGGTTTCCCGTTGATGACC-3′。建立20 μL PCR扩增体系：qPCR SuperMix 10 μL，α-SMA或TGF-β上下引物各2 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 6 μL。扩增条件：94 ℃、2 min，94 ℃、5 s，60 ℃、30 s 45个循环。以2-ΔΔCt表示细胞中受检基因mRNA的相对表达量。

1.4.2 各组细胞活化标志物α-SMA、TGF-β蛋白检测 采用Western blotting法。取各组细胞，RIPA细胞裂解液提取各组细胞总蛋白，二喹啉甲酸（BCA）法测定蛋白浓度；取相同质量的蛋白上样，经SDS-PAGE电泳后转移至聚偏乙烯（PVDF）膜；将转好的膜于室温下脱色摇床上用5%的脱脂牛奶封闭1 h。α-SMA（1∶2000稀释）、TGF-β（1∶2000稀释）、GAPDH（1∶5000稀释），一抗按照相应稀释比例溶解于5%脱脂牛奶，4 ℃孵育过夜。用TBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次5 min；再用二抗室温下孵育30 min后，用TBST室温下脱色摇床洗脱三次，采用ECL化学发光法进行曝光显影。使用Image J v1.80测量条带的灰度值，以GAPDH为内部参考蛋白，计算目的蛋白的相对表达量。

1.5 各组细胞自噬标志物LC3、Beclin-1、Atg5检测

1.5.1 各组细胞自噬标志物LC3、Beclin-1、Atg5 mRNA检测 检测方法参照“1.4.1”，其中目的基因LC3上游引物5′-TGTTAAGCCCCTACCAAGGC-3′，下游引物5'-CATGGCACTCAGTTTCTGGC-3'；Beclin-1上游引物为5'-CTCGTCAAGGCGTCACTTCT-3'，下游引物5'-CCTCCATTCTTTAGGCCCCG-3′；Atg5上游引物5'-CTCAGCTCTGCCTTGGAACA-3'，下游引物5'-CATCCAGAGCTGCTTGTGGT-3'。

1.5.2 各组细胞自噬标志物LC3、Beclin-1、Atg5蛋白检测 检测方法参照“1.4.2”，其中LC3以1∶2000稀释、Beclin-1以1∶500稀释、Atg5以1∶2000稀释。

1.6 统计学方法 采用SPSS24.0统计软件。计量资料呈正态分布时以±s表示，多组间比较用单因素方差分析，两两比较用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞活化标志物α-SMA、TGF-β表达比较

2.1.1 各组细胞活化标志物α-SMA、TGF-β mRNA相对表达量比较 空白组、TGF-β+PBS组、TGF-β+3-MA组细胞中α-SMA mRNA相对表达量分别为1.00 ± 0.00、6.37 ± 0.24、3.39 ± 0.09，组间相比，P均＜0.05；空白组、TGF-β+PBS组、TGF-β+3-MA组细胞中TGF-β mRNA相对表达量分别为1.00 ± 0.00、9.24 ± 0.23、4.13 ± 0.08，组间相比，P均＜0.05。

2.1.2 各组细胞活化标志物α-SMA、TGF-β蛋白相对表达量比较 空白组、TGF-β+PBS组、TGF-β+3-MA组细胞中α-SMA蛋白相对表达量分别为0.05 ±0.01、0.55 ± 0.19、0.30 ± 0.07，组间相比，P均＜0.05；空白组、TGF-β+PBS组、TGF-β+3-MA组细胞中TGF-β蛋白相对表达量分别为0.03 ± 0.00、0.44 ±0.07、0.27 ± 0.02，组间相比，P均＜0.05。

2.2 各组细胞自噬标志物LC3B、Beclin-1、Atg5表达比较

2.2.1 各组细胞自噬标志物LC3、Beclin-1、Atg5 mRNA相对表达量比较 空白组、TGF-β+PBS组、TGF-β+3-MA组细胞中LC3 mRNA相对表达量分别为1.00 ± 0.00、5.77 ± 0.15、2.11 ± 0.07，组间相比，P均＜0.05；空白组、TGF-β+PBS组、TGF-β+3-MA组细胞中Beclin-1 mRNA相对表达量分别为1.00 ±0.00、4.45 ± 0.18、1.99 ± 0.08，组间相比，P均＜0.05；空白组、TGF-β+PBS组、TGF-β+3-MA组细胞中Atg5 mRNA相对表达量分别为1.00 ± 0.00、5.77 ±0.90、2.06 ± 0.03，组间相比，P均＜0.05。

2.2.2 各组细胞自噬标志物LC3、Beclin-1、Atg5蛋白相对表达量比较 空白组、TGF-β+PBS组、TGF-β+3-MA组细胞中LC3蛋白相对表达量分别为0.16 ±0.03、0.99 ± 0.13、0.40 ± 0.08，组间相比，P均＜0.05；空白组、TGF-β+PBS组、TGF-β+3-MA组细胞中Beclin-1蛋白相对表达量分别为0.36 ± 0.08、0.69 ± 0.06、0.33 ± 0.02，组间相比，P均＜0.05；空白组、TGF-β+PBS组、TGF-β+3-MA组细胞中Atg5蛋白相对表达量分别为0.05 ± 0.01、0.55 ± 0.19、0.30 ± 0.07，组间相比，P均＜0.05。

3 讨论

肝纤维化是一种伤口愈合反应，其特征是ECM的过度沉积和积累，可在多种触发因素下发生，这些触发因素可导致不同病因的慢性肝病，如慢性炎症、病毒性肝炎和代谢性肝病［7］。在纤维化形成过程中，HSC作为多种外界因素入侵的靶细胞，可通过上皮间充质转化反应（epithelial mesenchymal transition，EMT）转变为肌成纤维细胞并诱导肝纤维化。α-SMA仅存在于肝脏大血管平滑肌，在HSC向肌成纤维细胞转化时，其会出现在肝脏内［8］，故α-SMA被认为是HSC活化的重要标志。TGF-β被认为是激活HSC的关键调节因子［9］。TGF-β可触发HSC反式分化，直接诱导应激纤维化组织。本研究使用TGF-β诱导HSC-T6细胞株24 h，α-SMA、TGF-β在基因及蛋白表达水平上均显著升高，由此表明在实验中成功建立了体外肝星状细胞活化模型。

肝细胞是肝脏的主要实质细胞，对维持肝脏的功能和组织至关重要，其中HSC在肝纤维化发生过程中起关键作用，HSC激活可促进肝纤维化的发生［10］。因此，抑制HSC活化是治疗肝纤维化的潜在靶点。自噬是新发现的参与HSC活化和肝纤维化进程的一种机制，它通过输送甘油三酯等组分为HSC的活化提供能量［11］。自噬涉及功能失调的大分子和受损的细胞器的降解［12］，以支持细胞能量和代谢平衡，促进细胞器的再生［13］。自噬过程受到不同自噬基因自噬相关基因（autophagy-related gene，ATG）和自噬蛋白的调控，包括LC3、Beclin-1、mTOR、P62、Atg5、Atg8等，其中Beclin-1可调节自噬活性，是参与自噬调控的重要基因［14］。在细胞内存在两种形式的LC3蛋白：LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ。LC3蛋白在合成后其C端即被ATG4蛋白酶切割变成LC3-Ⅰ，分布于细胞浆内。当自噬体形成后，LC3-Ⅰ和磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine， PE）偶联形成LC3-Ⅱ并定位于自噬体内膜和外膜，并稳定地保留在自噬体膜上直到与溶酶体融合。因此，LC3-Ⅱ被用来作为自噬体的标记，其表达水平在某种程度上反映了自噬体的数量［15］。当自噬发生时，自噬体数量增加，自噬通量上调。Atg5是一种在自噬过程中起关键作用的蛋白质，其可催化形成磷脂酰乙醇胺（PE）连接的LC3（LC3-Ⅱ），并将其正确地结合到吞噬体膜上，参与自噬体的形成［16］。本研究结果显示，TGF-β+PBS组中LC3、Bclin-1、Atg5基因及蛋白表达水平均上调，提示肝星状细胞活化过程中存在自噬，且肝星状细胞活化可通过自噬途径激活。有研究［17］在使用卡维地洛干预HSC活化实验中发现，卡维地洛可通过抑制自噬通量显著降低LX-2细胞的活化。

3-MA是PI3K的特异性抑制剂，可通过PI3K/Akt/mTOR途径抑制细胞自噬，也是目前最常使用的自噬抑制剂。3-MA能抑制LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化从而干扰或阻断自噬体的形成［18］。本研究采用3-MA作用于HSC-T6细胞后，TGF-β+3-MA组的LC3、Beclin-1、Atg5基因及蛋白水平均低于TGF-β+PBS组，且α-SMA和TGF-β mRNA和蛋白水平也同样显著下降。因此，进一步验证HSC自噬水平在维持其活化状态中具有一定的重要性，同时也表明3-MA改善肝纤维化可以通过抑制自噬来抑制肝星状细胞活化来实现。

综上所述，体外3-MA干预能降低自噬相关蛋白LC3、Beclin-1、Atg5的表达水平，并下调HSC活化标志蛋白α-SMA表达以及TGF-β的表达水平，这些结果表明，3-MA可抑制TGF-β诱导的大鼠肝脏星形细胞株HSC-T6活化及自噬，为3-MA作为开发预防和治疗肝纤维化的药物提供了一定的理论基础。