基于微流控技术的检测系统在献血初筛中的应用评估

傅立强 桑列勇 王琴 余波 张凯君 赵逸祥 吴和晋

(1.绍兴市中心血站，浙江 绍兴 312000；2.浙江普施康生物科技有限公司)

根据我国采供血机构相关法规、标准要求，血 站必须在献血者献血前对其进行血红蛋白(Hb)检测[1]，同时血站可以根据实际情况增加丙氨酸氨基转移酶(ALT)等检测项目[2]，以保障献血者健康和减少血液报废率。 目前在采供血机构，献血前Hb与ALT 检测方法多样，Hb 检测主要是硫酸铜比重法(定性)和Hb 检测仪法(定量)[3]，ALT 检测为干化学法与速率法[3-4]，2 个项目多不是联合检测因此会降低整体筛选的效率。 基于此类现状，寻找快速、便捷、准确并能同时进行Hb/ALT 等项目联合检测的设备与方法显得很有必要。 微流控盘片技术，始于20 世纪90 年代，由Manz 等[5]首创，他们成功利用这项技术进行了体外细胞的电泳分离，1995 年，美国国防部推出了便携式士兵生化自检设备计划，此举引起了国际社会对微流控盘片的关注。 此后，越来越多的专家学者开始认为微流控盘片是分析化学的理想平台，并将其称为“微型全分析系统”(μTAS)[6-7]。 微流控盘片将传统实验室中的标本制备、反应、分离、检测等所有操作步骤都集中于1 个盘片上[8]，微小化同时带来减少标本或试剂用量的优点、具有较低制造成本和较小体积且方便携带、在1 个盘片上同时进行多个平行检测，易于集成，目前已经成为分析学科最活跃的发展前沿，代表着未来分析仪器走向微型化、集成化的发展方向[9]。 离心微流控技术为其中的分支之一，除了具有微流控技术的优点之外，不须外加泵只需要单一马达即可驱动流体、在盘片上可自动快速全血分离也是该技术独特优点。 本站与合作单位基于离心微流控技术，通过对试剂冻干、光学比色等技术进行整合，共同开发了1 套针对Hb 与ALT 项目进行同步、快速检测的系统设备——MS200 生化分析仪与配套的ALT/Hb 检测冻干试剂盘(微流控盘片＋冻干微球试剂)，并开始试用于献血前筛查。为评价其检测稳定性、准确性、应用价值与前景，我们已经进行了精密度与准确度的验证，并与其他设备进行了比较，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 标本来源

本研究纳入的标本均在2023 年8—10 月采集。 献血者标本:1 189 份指尖末梢血标本(150 μL/份)；1 040 份初筛合格并成功献血留取的EDTA 抗凝全血常规标本(血袋旁路留样，5 mL/份)；对5 名ALT＞50 U/L 的献血者与5 名Hb＜115 g/L的献血者，征得本人同意后，每人各采EDTA 抗凝全血试验标本1 份(5 mL/份)，共10 份；102 份单采血小板献血者EDTA 抗凝全血常规标本(5 mL/份)。患者标本:20 份ALT 异常[(51 ～470) U/L] EDTA抗凝全血标本，20 份Hb 异常[(52 ～115、161 ～185) g/L]EDTA 抗凝全血标本，所有患者标本由绍兴市上虞中医院提供；自制质控品[从1 040 份献全血常规标本与102 份献单采血小板常规标本中挑取ALT(40 ～50)U/L、Hb(120 ～130)g/L 的标本作为自制质控品，有效期1 周]。

1.2 试剂与仪器

ALT/Hb 检测冻干试剂盘(常德普施康公司，批号:202305099—202306002)；ALT 检测试剂盒(贝克曼库尔特公司，批号:AUZ0960)；Hb 检测试剂片(HemoCue AB 公司，批号:2203194)；血细胞分析用溶血剂FFD-201A(Sysmex 公司，批号:A3009)与SLS-211A(Sysmex 公司，批号:A3022)，血细胞分析用稀释液PK-30L(Sysmex 公司，批号:G3024)；生化多项定值质控品(中生北控公司，批号210161)；MS200 生化分析仪(浙江普施康公司)；AU480 全自动生化分析仪(贝克曼库尔特公司)；Hb201 分析仪(HemoCue 公司)；XS-900i 血细胞分析仪(Sysmex 公司)。

1.3 方法

1.3.1微流控盘片检测系统原理

MS200 生化分析仪包含3 个主要部分:控制单元、检测单元和管理单元。 控制单元的功能是控制直流无刷电机，实现加速、减速及转向，为微流控盘片提供离心驱动力用以离心标本，同时精确控制标本在管路系统中的流动。 检测单元中的光源发出340 nm、546 nm 等波长的光线，光线穿过微流控盘片的反应孔，并经过分光和滤光处理后被光检测器捕获。 这些光信号经过处理后，管理单元根据朗伯-比尔定律，分析标本在紫外光和可见光区域的吸收光谱，通过光谱数值与标准曲线的比对，得出标本中的ALT 和Hb 浓度，检测只需向标本加样孔加入45 μL 全血标本即可启动，但需5 min 后才能出结果。 整个系统的核心是ALT/Hb 检测冻干试剂盘:它是1 种微型化的离心反应器，形状半圆，厚0.5 cm，半径4 cm，由2 层结构构成:上层是刻有微流道的聚甲基丙烯酸甲酯盘片，下层是压力敏感胶来贴合并封闭微流道。 试剂通过冻干微球技术制作成球状颗粒并预置在盘片内，标本与这些冻干球接触时，能迅速复溶并反应，见图1。

图1 微流控盘片Figure 1 Microfluidic disc

1.3.2标准曲线绘制

1.3.2.1测试方法

用MS200 生化分析仪进行全流程模式测试，测试标本为纯化水和企业参考品，参考品各个浓度值重复测试3 次取均值。

1.3.2.2KB 值标定方法

1.3.2.2.1ALT

斜率计算公式:吸光度＝log10(参比/检测)，斜率(K)＝(A2-A1)/(t2-t1)。 其中:A1 为第1 个时间点t1 读取的吸光度，A2 为第2 个时间点t2 读取的吸光度，2 个时间点选择跟项目相关。 ALT 项目中t1 为第5 个采样点，即第20 s，t2 为第15 个采样点，即第60 s。 将相关数值代入公式计算，得到斜率K1、K2。 以斜率为X 轴，浓度[企业参考品溯源至GBW(E)090164 的标准物质]为Y 轴进行线性拟合，得到1 条y ＝kx＋b 的定标曲线。

1.3.2.2.2Hb

终点法计算公式:吸光度＝log10(参比/检测)，终点讯号值(B)＝A15，即第60 s 读取的吸光度，仪器15 次采样下的吸光度分别为A1—A15。 分别计算2 个浓度测试结果得到B1、B2。 以吸光度为X轴，浓度(企业参考品溯源至HiCN 法定值的新鲜血)为Y 轴进行线性拟合，得到1 条y ＝kx＋b 的定标曲线。

1.3.3检测方法

1.3.3.1质量控制设备使用前用自制质控品进行检测，并绘制质控图，只有检测值在控(检测值在±2SD 内)才可开展日常检测。

1.3.3.2检测值覆盖范围

ALT:(5～470)U/L；Hb:(52～185)g/L。

1.3.3.3精密度、准确度估计及判定标准

从1 040 份献血者全血常规标本中选取经XS-900i 血细胞分析仪3 次测定，Hb 均值(靶值)分别为118 g/L 和152 g/L 的2 份标本做Hb 检测；从1 040份献血者全血常规标本中选取经AU480 生化分析仪测定3 次，ALT 均值(靶值)为48.0 U/L 的1份标本，外加1 份已知ALT 值的高值质控品进行ALT 检测。 批内精密度试验:用MS200 生化分析仪1 d 内连续检测上述标本各10 次，计算±s和CV；批间精密度试验:每天用MS200 生化分析仪检测上述4 个标本2 次，连续5 d，计算±s和CV。判断标准参照文献[10-11]:批内CV，Hb≤1.5%、ALT＜5.0%，批间CV，Hb≤2.0%、ALT＜6.7%；准确度试验:用MS200 生化分析仪连续检测上述4 个标本各3 次，计算值并与靶值比较，判断标准参照文献[10-11]:相对偏倚Hb≤2.5%、ALT＜10.0%。

1.3.3.4MS200 生化分析仪与其他检测系统的比较

先用Hb201 分析仪对1 189 份献血者指尖末梢血标本进行Hb 检测(专用试剂片自动吸取标本约10 μL)，再用MS200 生化分析仪对1 189 份献血者指尖末梢血标本进行Hb/ALT 同步检测(用移液器吸取标本45 μL 注入微流控盘片标本加样孔)，Hb 检测值以Hb201 分析仪的结果为准；用MS200生化分析仪对20 份ALT 异常患者标本、20 份Hb异常患者标本进行检测；用AU480 生化分析仪对1 040份献血者全血常规标本、5 份ALT＞50 U/L 全血试验标本、20 份ALT 异常患者标本(合计1 065份标本)进行ALT 检测，并与MS200 生化分析仪的ALT 检测结果进行比较；用XS-900i 血细胞分析仪对1 040 份全血常规标本中的40 份标本、5 份Hb＜115 g/L 全血试验标本、20 份Hb 异常患者标本(合计65 份标本)进行Hb 检测，并与MS200 生化分析仪的Hb 检测结果进行比较。

1.3.3.52 检测项目间干扰验证

从5 份ALT ＞50 U/L 全血试验标本中选取AU480 生化分析仪ALT 检测值分别为62.5 U/L、117.0 U/L 的标本各1 份，用XS-900i 血细胞分析仪检测其Hb 值并与MS200 生化分析仪检测值比较，相对偏倚≤2.5%为无干扰。 从Hb 异常患者标本中选取ALT 值为30 ～50 U/L 且XS-900i 血细胞分析仪Hb 检测值分别为84 g/L、172 g/L 的标本各1 份，用AU480 生化仪检测其ALT 值并与MS200 生化分析仪检测值比较，相对偏倚＜10.0%为无干扰。

1.4 统计学分析

用Minitab15.0 统计软件进行数据处理，相关性采用线性回归分析，计数资料用百分比(%)表示，采用χ2检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Hb 检测结果

2.1.1精密度与准确度测定结果

精密度测定结果见表1，2 个标本均为批内CV≤1.5%，批间CV≤2.0%，符合标准要求；准确度测定结果见表2，2 个标本与靶值的相对偏倚均≤2.5%，符合标准要求。

表1 Hb 检测精密度测定结果Table 1 Precision test result of Hb detection

表2 Hb 检测准确度测定结果Table 2 Accuracy test result of Hb detection

2.1.2与其他检测系统的比较结果

1 189 份献血者指尖末梢血标本，Hb201 生化分析仪与MS200 生化分析仪Hb 检测不合格率分别为2.69%(32/1 189)与2.78%(33/1 189)，其中31 份标本2 者结果均为不合格，2 者结果比较无差异(χ2＝0.016，P＜0.05)；65 份标本MS200 生化分析仪与XS-900i 血细胞分析仪检测结果相关性分析显示2 者呈正相关，Y ＝0.983X ＋2.788(R2＝0.986，P＝0.000)，见图2。

图2 MS200 与XS-900i Hb 检测结果拟合图Figure 2 Fitting diagram of Hb detection results for MS200 and XS-900i

2.2 ALT 检测结果

2.2.1精密度与准确度测定结果

精密度测定结果见表3，2 个标本均为批内CV＜5.0%，批间CV＜6.7%，符合标准要求；准确度测定结果见表4，2 个标本与靶值的相对偏倚均＜10.0%，符合标准要求。

表3 ALT 检测精密度测定结果Table 3 Precision test result of ALT detection

表4 ALT 检测准确度测定结果Table 4 Accuracy test result of ALT detection

2.2.2与其他检测系统的比较结果

1 065 份标本MS200 生化分析仪与AU480 生化分析仪ALT 检测全部结果相关性分析显示2 者呈正 相关，Y ＝0.975X ＋0.887(R2＝0.965，P＝0.000)，见图3；其中AU480 生化分析仪ALT 检测值为30～80 U/L 的210 份标本2 设备检测结果相关性分析显示其2 者呈正相关，Y ＝0.904X＋3.232(R2＝0.825，P＝0.000)，见图4。

图3 MS200 与AU480 ALT 检测全部结果拟合图Figure 3 Fitting diagram of all ALT detection results for MS200 and AU480

图4 MS200 与AU480 ALT(30～80 U/L)标本检测结果拟合图Figure 4 Fitting diagram of ALT (30—80 U/L) sample detection results for MS200 and AU480

2.3 2 项目间干扰验证

2 份ALT 高值标本2 种设备Hb 检测值分别为135 g/L 与134 g/L、147 g/L 与149 g/L，偏倚均≤2.5%，ALT 高值标本对Hb 的检测无干扰。 2 份Hb值异常标本2 种设备ALT 检测值分别为35.6 U/L与36.4 U/L、43.5 U/L 与44.7 U/L，偏倚均＜10.0%，Hb 值异常标本对ALT 的检测无干扰。

3 讨论

检测方法的确认是证实1 种在实验室使用的方法(检验标准)适用性的过程。 对检测方法的确认要尽可能全面，并通过客观证据(以性能特征形式)证实满足检测预期用途的特定要求[12]。 方法确认是保证检测结果准确性的前提。 对性能指标进行验证，并与其他检测系统的比较，可以获得该方法能够得到准确、稳定检测结果的证据。 精密度是多次独立重复检测结果之间的一致性，反映测量结果的可重复性，包括批内精密度和批间精密度。准确度是多次检测结果的平均值和靶值间的接近程度，以偏倚为评价指标。 MS200 生化分析仪Hb/ALT 检测批内和批间精密度变异系数、与靶值的相对偏倚均符合行业标准，表明其检测Hb/ALT 精密度高，重复性好、结果准确，达到质量要求。

Hb 检测可以用于更准确地评估献血量和降低献血不良反应的发生机率，从而更好地保护献血者的健康[13-14]，因此开展Hb 定量检测非常必要。ALT 作为输血传播疾病的1 项非特异性检测指标，由于其受非病理性因素、季节性变化和性别生理等因素影响，ALT 异常在正常献血人群中比例较高，这也是造成血液报废的主要原因[15-16]，做好献血前ALT 筛查非常重要。 MS200 生化分析仪的Hb 检测结果与Hb201 分析仪检测结果高度一致(Hb201分析仪的检测准确性已得到多方验证[17-18])，与XS-900i 血细胞分析仪检测结果呈正相关；MS200生化分析仪的ALT 检测结果与AU480 生化分析仪检测结果呈正相关；MS200 生化分析仪的Hb/ALT检测中，ALT 高值标本对Hb 的检测结果、Hb 值异常标本对ALT 检测结果均不产生影响，2 项目间检测无干扰。 本研究结果显示基于微流控技术的检测系统在性能上已经和常规使用的其他检测系统不相上下。

总之，MS200 生化分析仪及其配套试剂作为基于微流控技术，专门用于献血者献血前检测的便携式初筛设备，有较多优点，比如标本无需离心且用量小、操作简便、自动化程度高、可实现Hb/ALT 联合检测、无废液产生等；但也存在一些不足，比如检测时间相对于其他设备偏长。 我们会进一步提升设备检测盘位数，通过通道增加来缩短检测时间，加强工作人员使用和设备的磨合，进一步提升检测稳定性。