海马干细胞来源的外泌体对血管性痴呆大鼠学习记忆能力改善作用及其机制探究

潘成利,黄月萍,薛炬君,陈 曦,齐 丹,侯晓君,孙 爽,王喜春,付宏娟

(黑龙江省医院 老年神经内科,黑龙江 哈尔滨150036)

随着社会的发展,人们生活节奏加快,血管性痴呆的发病率正逐年提高,据统计,血管性痴呆的五年病死率超过65%,现已成为影响人们生命健康及生存质量的重要疾病[1]。目前,关于血管性痴呆的发病机制尚不明确,可能与慢性脑灌注不足、钙超载、炎性反应以及凋亡通路的激活具有重要关系[2]。有研究发现,当海马部位神经元处于慢性缺血性坏死状态时,会出现迟发性认知功能障碍[3]。外泌体为细胞分泌的直径30～100 nm的细胞外囊泡,几乎存在于所有细胞中,有研究发现,在生理或病理条件下中枢神经系统中的细胞均能够分泌外泌体[4]。据相关报道[5],外泌体的低免疫原性、能够穿过血脑屏障以及循环半衰期长等特征可用于治疗中枢神经系统疾病。本研究旨在探究海马干细胞来源的外泌体对血管性痴呆大鼠学习记忆能力的改善作用及其相关机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

特殊清洁级(SPF)健康雄性SD大鼠 (北京维通利华实验动物技术有限公司),体重212±15 g,周龄8周,所有实验均在温度23±2℃,湿度50%±15%,昼夜比例1∶1的环境中适应性饲养7 d。

1.2 主要仪器及试剂

低温高速离心机(上海精密仪器仪表有限公司);透射电子显微镜(北京仪信网通科技有限公司);恒温水浴箱(上海赫田科学仪器有限公司);石蜡切片机(上海之信仪器有限公司);-80℃超低温冰箱(中科美菱生物医疗股份有限公司);苏木精(上海美轩生物科技有限公司);无水乙醇(苏州欧特化工有限公司);Morris水迷宫(江苏赛昂斯生物科技有限公司);10%水合氯醛(青岛宇龙海藻有限公司);Bcl-2检测试剂盒(上海晶抗生物工程有限公司);Bax检测试剂盒(上海将来实业股份有限公司)。

1.3 海马干细胞提取

取10只大鼠处死,取大鼠海马组织,充分裂解制成单细胞悬液,离心,取上清液,采用增殖培养液重悬细胞,当细胞形成神经球后消化传代,将细胞培养至4代,当细胞融合至85%左右时换为无血清培养基培养48 h,离心,取上清液,再次离心后进一步浓缩上清液,加入外泌体沉淀液,混匀,在4℃条件下静置过夜,离心,去除上清液,所得沉淀物即为海马干细胞外泌体。

1.4 建立大鼠血管性痴呆模型

建立大鼠血管性痴呆模型:建模前大鼠禁食10 h。将大鼠麻醉,取仰卧位固定于实验台上,颈部备皮,分离两侧颈总动脉,腹腔注射硝普钠造成低血压,注射完成后将双侧颈总动脉夹闭15 min左右,放开动脉夹约15 min,再次夹闭约15 min,操作3次,缝合皮肤及各层肌肉,在手术创口处喷洒及注射抗生素防止感染。过程中注意对大鼠进行保温。

将大鼠随机分为假手术组、模型组及外泌体组3组,每组大鼠30只。其中,假手术组不注射硝普钠,阻断颈总动脉。外泌体组尾静脉注射30 μg海马干细胞来源外泌体,模型组及假手术组注射等剂量生理盐水。

1.5 观察指标

1.5.1海马干细胞外泌体观察 取外泌体沉淀物,加入磷酸盐缓冲液溶解,取上清液加至载样铜网上,使用磷钨酸溶液染色,采用透射显微镜观察记录。

1.5.2Morris水迷宫实验对大鼠的学习及记忆能力进行检测 将水迷宫分为4个区域,在每个区域内进行入水点标记设置,将一隐蔽的圆形平台放于第三区域。在定向航行试验中(每天3次,共4 d),每次随机选取一个区域入水,在60 s内找到圆形平台的时间为逃避潜伏期。观察并记录大鼠找到并爬上平台所需时间。第5天时将平台撤去进行空间探索实验,从原区域入水,记录大鼠在100 s内找到原平台区域的探索时间,若在60 s内未找到平台,则需将大鼠引到平台。48 h后重复实验,观察并记录大鼠逃避潜伏期时间变化、平台区域探索时间,有效区停留时间及错误次数。

1.5.3氧化应激因子检测 行为学检测结束后,取大鼠心脏血,离心,取上清液,采用硫代巴比妥显色法检测血清丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)水平。操作步骤均严格按照操作说明书进行。

1.5.4海马组织病理学检测 将大鼠处死,取海马组织,采用HE染色法观察大鼠海马组织病理学变化。取海马组织,常规制作石蜡切片,将切片放入70℃烤箱烘烤过夜,二甲苯脱蜡,梯度酒精脱水,磷酸盐缓冲液冲洗,苏木素染液,盐酸酒精分化,自来水冲洗,伊红染液染色,自来水冲洗,经梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片,使用显微镜进行观察。

1.5.5海马组织因子检测 采用酶联免疫吸附法检测海马组织乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase,AchE)、5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)、内皮素-1(Endothelin-1,ET-1)及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)水平。所有操作步骤均严格按照操作说明书进行。

1.5.6脑微血管密度检测 采用免疫组化法检测各组大鼠海马组织脑微血管密度变化。取海马组织,常规脱水后包埋成蜡块,其放入切片机中切成5 μm厚度的切片,放入烤箱中烤干。将切片浸入枸橼酸溶液中高温煮沸并冷却进行抗原修复,将切片静置自然冷却至37℃加入BDNF及Trk B抗体孵育1 h,使用磷酸盐缓冲液冲洗3次,每次3 min,采用免疫组化法进行染色,DAB显色5 min,苏木精进行复染、脱水、透明、封片。显微镜观察记录。

1.5.7凋亡因子检测 采用蛋白质印记法检测各组大鼠海马组织凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax表达水平。取海马组织充分裂解,离心,取上清液。配制BCA工作液,充分混匀,各孔加入200 μL BCA工作液,测定蛋白浓度,将各管蛋白稀释至7 μg/μL;将蛋白质进行变性处理,制备10 mL SDS-聚丙烯酰胺分离胶及4 mL SDS-聚丙烯酰胺堆积胶,经上样、电泳、转膜后封闭;加入Bcl-2、Bax一抗,在4℃条件下摇床过夜,磷酸盐缓冲液冲洗,加入二抗;滴加显影液,使其均匀覆盖,避光孵育2 min,放于凝胶成像系统中显影,检测目的蛋白的相对光密度值。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 透射显微镜下海马干细胞来源外泌体形态

透射显微镜观察到外泌体结构呈圆形或椭圆形杯状结构的小囊泡,其结构完整,直径50～100 nm之间。经蛋白质印记法检测发现外泌体中均有特异性标记蛋白CD9、CD63阳性表达。见图1～2。

图1 透射显微镜下海马干细胞来源外泌体形态

图2 细胞外泌体表面标志物CD9、CD63检测

2.2 各组大鼠学习记忆能力变化

与假手术组比较,模型组大鼠逃避潜伏期及错误次数明显延长,平台区域探索时间及有效区停留时间明显缩短(P<0.05);与模型组对比,外泌体组大鼠逃避潜伏期明显缩短,平台区域探索时间及有效区停留时间明显延长(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠学习记忆能力变化

2.3 各组氧化应激因子对比

与假手术组比较,模型组大鼠血清MDA水平明显升高,SOD水平明显降低(P<0.05);与模型组比较,外泌体组大鼠血清MDA水平明显降低,SOD水平明显升高(P<0.05)。见表2。

表2 各组氧化应激因子对比

2.4 各组大鼠海马组织病理学组织变化

假手术组大鼠海马组织细胞排列紧密,结构清晰,大小、形态一致,且具有丰富的尼氏小体;模型组大鼠海马组织细胞排列紊乱,形态、结构不完整,尼氏小体数量明显减少;外泌体组大鼠海马组织较模型组明显改善,细胞形态较模型组明显完整,尼氏小体数量增多。见图3。

图A:假手术组;图B:模型组;图C:外泌体组

2.5 各组大鼠海马组织AchE、5-HT、ET-1、VEGF表达水平对比

与假手术组比较,模型组大鼠海马组织AchE、ET-1、VEGF表达水平均明显升高,5-HT水平明显降低(P<0.05);与模型组比较,外泌体组大鼠海马组织AchE、ET-1、VEGF表达水平均明显升高,5-HT水平明显降低(P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠海马组织AchE、5-HT、ET-1、VEGF表达水平对比

2.6 各组大鼠海马组织脑微血管密度对比

与假手术组比较,模型组大鼠脑微血管内皮细胞明显减少(P<0.05);与模型组比较,外泌体组大鼠脑微血管内皮细胞明显增多(P<0.05)。见表4。

表4 各组大鼠海马组织脑微血管密度对比

2.7 各组大鼠海马组织凋亡因子对比

与假手术组比较,模型组大鼠海马组织Bax表达水平明显升高,Bcl-2表达水平明显降低(P<0.05);与模型组比较,外泌体组大鼠海马组织Bax表达水平明显降低,Bcl-2表达水平明显升高(P<0.05)。见表5,图4。

表5 各组大鼠海马组织凋亡因子对比

图4 各组大鼠海马组织凋亡因子对比

3 讨论

血管性痴呆是一种中枢神经系统性疾病且再生及修复能力较弱,其受损神经功能难以恢复。目前,关于血管性痴呆的发病机制尚不明确,同时缺乏有效治疗的药物,因此建立血管性痴呆大鼠模型,分析讨论血管性痴呆的发生机制,对疾病的早期治疗、诊断及预防具有重要作用。近年来,随着对干细胞研究的不断深入,人们逐渐尝试将干细胞移植用于中枢神经系统疾病的治疗,并取得了一定效果。研究表明[6],移植的干细胞主要通过旁分泌的方式发挥治疗作用,而外泌体是细胞发挥旁分泌作用的关键。越来越多的研究发现[7-8],干细胞来源的外泌体具有与其母体干细胞相似的功能作用。脂肪间充质干细胞来源的外泌体在肾缺血再灌注损伤的治疗中具有重要作用。骨髓干细胞来源的外泌体能够明显改善神经损伤大鼠模型中的勃起功能障碍。本研究旨在探究海马干细胞来源的外泌体在血管性痴呆大鼠学习记忆能力方面的改善作用及相关机制。

认知功能障碍是血管性痴呆最基本且最典型的症状。动物行为学测试常应用于神经科学的多个领域,尤其是在评估认知功能障碍相关性疾病的动物模型等发挥着重要作用[9]。本组研究中采用Morris水迷宫实验测定各组大鼠学习及记忆功能,结果发现,血管性痴呆大鼠空间学习及记忆功能明显下降。这可能是因为海马是学习、记忆的关键脑区,海马神经元损伤是造成记忆功能障碍的重要原因,当发生血管性痴呆时,大量自由基产生、兴奋性氨基酸及细胞内钙超载,使海马神经元发生缺失,进而对大鼠的空间学习记忆能力产生影响[10]。而尾静脉注射海马干细胞来源的外泌体能够明显改善血管性痴呆大鼠的学习记忆能力。此外,本研究结果发现,当发生血管性痴呆后,海马组织出现明显的病理学改变,椎体细胞出现明显坏死,细胞明显减少。这可能是因为海马区对缺血缺氧十分敏感,当发生缺血缺氧后,海马区神经元受到损伤,从而发生坏死脱落[11]。海马干细胞来源的外泌体对海马组织的损伤具有一定的治疗作用。

MDA为脂质过氧化的产物,有研究证实[12],MDA水平可能与细胞损伤程度明显相关。SOD是一种源于生命的活性物质,对清除机体新陈代谢废物,消除氧自由基具有重要作用。本研究结果发现,血管性痴呆大鼠血清MDA水平明显升高,SOD水平明显降低。这可能是因为,当发生脑损伤时,脑内氧自由基水平明显增加,进而损伤脑组织神经元。而人为静脉注射外泌体能够明显抑制MDA水平,促进SOD表达,抑制氧自由基水平,减少脑损伤,与DHALIWAL等[13]研究结果相似。

大脑海马区是学习记忆的重要结构,也是缺血缺氧非常敏感的脑区之一。有研究发现[14],血管性痴呆大鼠认知功能的改变可能与单胺类神经递质的释放及代谢关系密切。AchE是一种在学习记忆过程中起着重要作用的神经递质,相关研究发现[15],其在阿尔兹海默症等多种疾病中表达水平明显降低,且其水平与患者疾病呈明显负相关。5-HT主要表达于突触中,对突触的发育成熟及传递功能具有重要作用。研究表明[16],5-HT广泛存在与哺乳动物组织中,尤其在大脑皮层及神经突触中含量很高,能够促进神经元的分化作用。ET-1是一种缩血管肽,广泛存在于脑血管系统中,据报道[17],当发生脑缺血缺氧时,ET-1水平明显增加,可能会诱导神经细胞凋亡的发生,加重脑损伤,引起认知功能的改变。VEGF是一种血管形成因子,能够促进新生血管的生成。本组研究结果中,血管性痴呆大鼠海马组织AchE、ET-1、VEGF表达水平明显升高,5-HT表达水平明显降低,且海马组织脑微血管密度明显降低,海马干细胞来源的外泌体能够明显降低AchE、ET-1、VEGF水平,升高5-HT水平,促进脑组织血管新生。

细胞凋亡是一种正常过程,发展可受到多种基因的调控。Bcl-2与Bax均属于Bcl-2家族,在细胞凋亡过程中扮演着重要角色。其中,Bcl-2能够降低Bax浓度,影响细胞膜的通透性,抑制细胞凋亡的发生;Bax是一种促凋亡基因,能够促进细胞的凋亡[18-19]。既往有研究发现[20],凋亡不仅与神经系统的发育及可塑性具有重要关系,也可能与神经系统的病理状态具有重要关系。本研究结果发现,尾静脉注射海马干细胞来源的外泌体,能够明显促进Bcl-2/Bax表达水平,促进细胞凋亡。

综上所述,海马干细胞来源的外泌体能够明显改善血管性痴呆大鼠的学习记忆能力,对海马神经元损伤起到一定的保护作用,其作用机制可能与抑制氧化应激与细胞凋亡,调控神经递质含量,促进增加脑微血管密度有关。