连续流动分析法测定淡水中亚硝酸盐氮、硝酸盐氮、氨氮、总氮的研究

李亚 李会兰 李恒亮 朱吉东* 谭彦飞

（1.云南省生态环境厅驻文山州生态环境监测站，云南 文山 663099；2.昆明市生态环境局石林分局生态环境监测站，云南 昆明 650000）

1 引言

亚硝酸盐氮、硝酸盐氮、氨氮、总氮通常称之为“四氮”，是水质监测中几种常见的污染物，是环境监测中常规监测项目，也是评价水体受营养物质污染程度的重要指标之一，其测定结果有助于评价水体被污染和自净状况。高浓度的亚硝酸盐氮、硝酸盐氮、氨氮、总氮对水生生物有直接毒害作用，同时会引起水体富营养化，从而导致浮游生物急剧增殖，甚至可导致“赤潮”“水华”等灾害［1－3］。“十四五”时期是控制污染物排放增量，实现总量减排及改善生态环境质量的关键时期，国家向各省（区、市）下达主要污染物总量控制指标中就包括氮氧化物、氨氮2 个指标，因此研究“四氮”的测定方法对水环境监测具有重要的意义。

2 “四氮”的测定方法

氮氧化物污染中包括亚硝酸盐氮、硝酸盐氮，氨氮是水体中的主要耗氧污染物，对鱼类及某些水生生物有毒害作用，在一定条件下氨氮可转化成亚硝酸盐，水中的亚硝酸盐会进一步和人体内的蛋白质结合形成亚硝胺，亚硝胺是“三致”物质，属强致癌物质，如果长期饮用含亚硝酸盐的水，对人体健康极为不利。如果长期饮用硝态氮（NO3－N）含量超过10 mg/L 的水，则会发生高铁血红蛋白病症，如果血液中高铁血红蛋白含量达到70 mg/L 及以上，将危及人的生命健康，即发生窒息现象。亚硝酸盐氮是氮循环的中间产物；硝酸盐氮是以“NO3”形式存在的氮，水体中的硝酸盐氮是含氮有机物经无机化作用的最终分解产物；氨氮是指以氨或铵离子形式存在的化合氮，也是水中的一种营养物质；总氮是指水中各种形态的有机和无机氮的总量，包括亚硝酸盐、硝酸盐、氨氮等无机氮和蛋白质、氨基酸和有机胺等有机氮。水中“四氮”的测定对氮元素生物地球化学循环、人类赖以生存的生态系统结构的研究具有重要意义，如何快速精准地测定亚硝酸盐氮、硝酸盐氮、氨氮、总氮也是环境工作者研究的热点之一。

目前测定水中亚硝酸盐氮、硝酸盐氮最常用的方法是分光光度法、离子色谱法［4］；测定水中氨氮最常用的方法为纳氏试剂分光光度法；测定总氮最常用的方法为过硫酸钾—紫外分光光度法。而分光光度法检出限低，分析速度慢，操作步骤繁琐耗时，又耗费化学试剂，不能满足批量样品的快速测定要求，且显色剂有毒［5］；离子色谱法分析速度较慢，定性能力较差；过硫酸钾—紫外分光光度法采用高压蒸汽灭菌器进行消解，耗时较长，而且重复性及准确性较差［6］；纳氏试剂分光光度法中纳氏试剂毒性大，并且测量结果易受到水中悬浮物、余氯、钙镁等金属离子、硫化物和有机物的干扰，若存在上述干扰因子时，需要将水样进行相应的预处理后才能进行氨氮的分析工作［7］。

AA3 型连续流动分析仪（Continuous Flow Analyzer，CFA）是一种现代湿化学分析仪，可以分析大部分类型的液体样品［8］。该系统主要由全自动进样器、高精度蠕动泵、化学反应模块及数字比色计组成，采用空气片段连续流动分析技术，样品和试剂在一个连续流动的系统中均匀混合并发生反应，生成的有色化合物经过检测器比色，最后将比色信号输入电脑，软件进行自动分析的控制和计算。这种分析方法不仅速度快，节省人力、物力，而且精密度高，对环境污染小。

使用AA3 型连续流动分析仪测定水样的亚硝酸盐氮、硝酸盐氮、氨氮等已有相关研究［9－11］，但使用AA3 型连续流动分析仪同时测定亚硝酸盐氮、硝酸盐氮、氨氮、总氮的相关研究还不多见。本文利用连续流动分析仪分光光度法同时测定水中亚硝酸盐氮、硝酸盐氮、氨氮、总氮，并对其检出限、精密度、准确度、加标回收率进行分析讨论，检验该方法的准确性、精确度、快速性等，为含氮化合物的水质监测工作提供参考。

3 原理

3.1 连续流动分析仪工作原理

试样与试剂在蠕动泵的推动下进入化学反应模块，在密闭的管路中连续流动，被气泡按一定间隔规律地隔开，并按特定的顺序和比例混合、反应，显色完全后进入流动检测池进行光度监测。

3.2 化学反应原理

3.2.1 亚硝酸盐氮反应原理

在碱性介质中，试料中的亚硝酸盐和对氨基苯磺酰胺及N－（1－萘基）乙二胺二盐酸盐反应生成粉红色化合物，于550 nm 波长处测量吸光度。

3.2.2 硝酸盐氮反应原理

在碱性介质中，试料中的硝酸盐在铜的催化作用下，被硫酸肼及硫酸联氨还原成亚硝酸盐，并和对氨基苯磺酰胺及N－（1－萘基）乙二胺二盐酸盐反应生成粉红色化合物，于550 nm 波长处测量吸光度。

3.2.3 氨氮反应原理

在碱性介质中，试料中的氨、铵离子与二氯异氰脲酸钠溶液释放出来的次氯酸根反应生成氯胺。在40 ℃和亚硝基铁氰化钾存在条件下，氯胺与水杨酸盐反应形成蓝绿色化合物，于660 nm 处测量吸光度。

3.2.4 总氮反应原理

在碱性介质中，试料中的含氮化合物在107～110 ℃、紫外线照射下，被过硫酸盐氧化为硝酸盐后，硝酸盐被硫酸肼硫酸联氨还原成亚硝酸盐。在酸性介质中，亚硝酸盐与磺胺进行重氮化反应，然后与盐酸萘乙二胺偶联生成紫红色化合物，于波长540 nm处测量吸光度。

4 实验部分

4.1 主要仪器

德国SEAL Analytical 公司生产的AA3 连续流动分析仪（含在线消解模块）、ULUP－Ⅲ－20T 型优普超纯水机

4.2 试剂

所用试剂除另有注明外，均为符合国家标准的分析纯化学试剂；实验用水为新制备的去离子水，标准样品均购于生态环境部环境发展中心环境标准样品研究所。

4.2.1 亚硝酸盐氮试剂

润滑剂：取聚氧乙烯月桂醚（Brij－35）20 g 溶于去离子水中，稀释到100 mL。

显色剂：取磺胺5 g、N－（1－萘基）乙二胺二盐酸盐（NEDD）0.25 g、磷酸50 mL，去离子水稀释到500 mL。

氢氧化钠溶液（NaOH）：取氢氧化钠10 g、磷酸3 mL、Brij－35 溶液（20%）1 mL，去离子水稀释到1 000 mL。

4.2.2 硝酸盐氮试剂

润滑剂：取Brij－35 20 g 溶于去离子水中，稀释到100 mL。

显色剂：取磺胺5 g、N－（1－萘基）乙二胺二盐酸盐0.25 g、磷酸50 mL，去离子水稀释到500 mL。

氢氧化钠溶液：取氢氧化钠10 g、磷酸3 mL、Brij－35 溶液（20%）1 mL，去离子水稀释到1 000 mL。

硫酸铜储备液：取硫酸铜0.1 g，去离子水稀释到100 mL。

硫酸锌储备液：取硫酸锌1 g，去离子水稀释到100 mL。

硫酸联氨溶液：取硫酸铜储备液10 mL、硫酸锌储备液10 mL、硫酸联氨2 g，去离子水稀释到1 000 mL。

4.2.3 氨氮试剂

润滑剂：取Brij－35 20 g 溶于去离子水中，稀释到100 mL。

缓冲溶液：取柠檬酸三钠20 g、Brij－35 溶液（20%）1 mL，去离子水稀释到500 mL。

水杨酸钠：取水杨酸钠20 g、亚硝基铁氰化钠0.5 g，去离子水稀释到500 mL。

二氯异氰尿酸钠溶液（DIC）：取氢氧化钠10 g、二氯异氰尿酸钠1.5 g，去离子水稀释到500 mL。

4.2.4 总氮试剂

润滑剂：取Brij－35 20 g 溶于去离子水中，稀释到100 mL。

消解溶液：取四硼酸钠14 g、氢氧化钠3 g、过硫酸钾7 g，去离子水稀释到1 000 mL。

显色剂：取磺胺10 g、盐酸150 mL、N－（1－萘基）乙二胺二盐酸盐0.5 g，去离子水稀释到1 000 mL。

硫酸铜储备液：取硫酸铜0.1 g，去离子水稀释到100 mL。

硫酸锌储备液：取硫酸锌1 g，去离子水稀释到100 mL。

硫酸联氨溶液：取硫酸铜储备液10 mL、硫酸锌储备液10 mL、硫酸联氨2 g，去离子水稀释到1 000 mL。

氢氧化钠溶液：取氢氧化钠11.5 g、焦磷酸钠7 g，用去离子水稀释到1 000 mL，加入Brij－35 溶液（20%）2 mL。

5 结果与讨论

5.1 标准曲线

AA3 连续流动分析仪以质量浓度（mg/L）为横坐标、峰高数值信号为纵坐标，做线性拟合y＝b×x＋a，得出曲线方程和相关系数结果见表1。

表1 标准曲线与相关系数

“四氮”工作曲线见图1。由图1 可知，亚硝酸盐氮、硝酸盐氮、氨氮、总氮在标准曲线范围内具有良好的线性相关系数，相关系数r≥0.999，满足标准方法要求［12］。

图1 “四氮”工作曲线

5.2 检出限

按照HJ 168—2020《环境监测分析方法标准制订技术导则》［12］的规定，对浓度为0.01 mg/L 亚硝酸盐氮、0.02 mg/L 硝酸盐氮、0.05 mg/L 氨氮、0.1 mg/L总氮，分别重复测定7 次，并计算相应的标准偏差，按下面公式计算该方法的检出限：

式中，MDL 表示方法检出限；n 表示重复测定次数；t表示自由度为（n－1）、置信度为99%时的t 分布；S 表示n 次平行测定的标准偏差。

7 次测定t（6，0.99）=3.143，检出限测定结果见表2。由表2 可知，亚硝酸盐氮、硝酸盐氮、氨氮、总氮检出限分别为0.001 6，0.001 5，0.001 1，0.003 0 mg/L，检出限均小于GB/T 14848—2017《地下水质量标准》［13］Ⅰ类标准限值及GB 3838—2002《地表水环境质量标准》［14］Ⅰ类标准限值。

表2 检出限测定结果mg/L

表3 为国内相关方法检出限。由表3 可知，本次研究连续流动分析法测定的亚硝酸盐氮、硝酸盐氮、氨氮、总氮，其检出限、测定下限值均低于国内相关方法要求，对于低浓度样品的检测更为准确。

表3 国内相关方法检出限mg/L

5.3 精密度实验

精密度是指在同一条件下对同一样品进行多次测定结果的一致程度。精密度由随机误差决定，通常用标准偏差（SD）和相对标准偏差（RSD）等指标来表示。用标准溶液配置一定浓度的亚硝酸盐氮、硝酸盐氮、氨氮、总氮标准溶液，平行测定6 次，计算标准偏差和相对标准偏差，结果见表4。由表4可知，硝酸盐氮、硝酸盐氮、氨氮、总氮测定结果的相对标准偏差均小于10%，表明该方法的精密度良好。

表4 精密度测定结果

5.4 准确度实验

准确度表示被测量的量值与其真值间的一致程度，反映分析方法和分析测量系统存在的系统误差和随机误差的大小，即测量结果的可靠性，常用绝对误差、相对误差（RE）表征测定结果的准确度。对亚硝酸盐氮（200639）、硝酸盐氮（200849）、氨氮（2005148）、总氮（203270）的有证标准样品平行测定6 次，结果见表5。由表5 可知，亚硝酸盐氮、硝酸盐氮、氨氮、总氮的测定结果均在标准保证值范围内，且测定结果的RE 值＜10%，表明使用连续流动法测定亚硝酸盐氮、硝酸盐氮、氨氮、总氮的准确度高。

表5 准确度测定结果

5.5 加标回收率测定

对饮用水回龙水库水样分别加入低、中、高3个浓度梯度的标准溶液进行加标回收率实验，测定结果见表6。

表6 加标回收率测定结果

由表6 可知，亚硝酸盐氮的加标回收率在99.2%～106.0%、硝酸盐氮的加标回收率在99.7%～103.0%、氨氮的加标回收率在84.6%～102.0%、总氮的加标回收率在94.0%～100.0%，均得到较为满意的结果。

5.6 “四氮”关系对比

用连续流动分析法连续多个月对回龙水库的“四氮”进行测定，由监测结果可知，亚硝酸盐氮的年平均质量浓度为0.003 mg/L，占总氮比例0.49%；硝酸盐氮的年平均质量浓度为0.305 mg/L，占总氮比例47.0%；氨氮年平均质量浓度为0.033 mg/L，占总氮比例5.1%；总氮年平均质量浓度为0.649 mg/L。“四氮”关系测定结果对比见图2。由图2 可知，“四氮”关系符合要求［15－16］。“四氮”的浓度关系为：总氮＞硝酸盐氮＞氨氮＞亚硝酸盐氮。

图2 “四氮”关系测定结果

6 结论和建议

6.1 结论

使用AA3 连续流动分析仪测定水中亚硝酸盐氮、硝酸盐氮、氨氮、总氮4 个项目，其标准曲线的相关系数都在0.999 以上，均能够满足实验要求；亚硝酸盐氮、硝酸盐氮、氨氮、总氮方法检出限分别为0.001 6，0.001 5，0.001 1，0.003 0 mg/L，均低于国家相关方法的检出限；精密度测试结果显示，相对标准偏差均小于10%，精密度良好；准确度测试结果显示，有证标准样品的测定值均在保证值范围内，RE值＜10%，准确度较高；加标回收率测试结果显示，不同浓度试样的加标回收率都在80%～120%之间，加标回收率结果比较满意；“四氮”关系符合要求。

综上所述，用连续流动分析法测定淡水中的亚硝酸盐氮、硝酸盐氮、氨氮、总氮，仪器灵敏度较高、检出限低、测量样品的线性范围广、重复性和准确度较好。仪器操作简单快速，自动化程度高，可实现自动进样，仪器配有在线消解模块、在线加热模块和透析膜，样品可直接上机测试，简化了水样前处理过程，减少干扰因素，色度和浊度对分析过程几乎无影响，适用性强，试剂消耗少，环境污染小。整个实验反应过程在一个密闭的管路中进行，对实验人员身体伤害小，是传统分析技术结合现代数据处理技术的典型应用，可适用于大批量的样品分析，为含氮化合物的水质监测工作提供了一种可靠、简便而快捷的监测方法。

6.2 建议

（1）流动分析仪测定中每一个样品进入仪器后被气泡分割成20～30 个小片段，因此必须保证每一个测定的样品流片段在相同的时间、流速、温度等条件下进行反应，才能保证测定结果的准确度，所以在整个测试过程中要保证试剂充足，切忌做样过程中随意更换试剂或添加试剂，还需要随时关注仪器状态及实验环境的变化。

（2）流动分析仪的特殊之处就在于样品被气泡分割成多个小片段，因此要时刻关注气泡在管路中是否分布均匀，运行是否平稳，且气泡不会出现停顿或后退现象，如有此现象表明管路中的压力不正常，可能是管路中有沉淀，可使用0.1 mol/L 或0.5 mol/L的HCl 溶液、0.1 mol/L 或0.5 mol/L 的NaOH 溶液、蒸馏水依次清洗管路，或使用10%的次氯酸钠溶液清洗，或者按照仪器使用方法提供的特殊清洗液来清洗管路。

（3）连续流动分析仪属于高精密仪器，对所用的试剂纯度要求比较高，由于过硫酸钾、NaOH 中含有少量氮，测定总氮时所用的过硫酸钾为德国默克公司生产的进口试剂，所用NaOH 为优级纯，NaOH 容易吸收空气中的水和CO2，为保证测定结果的准确性，NaOH 要密封干燥保存，在测定总氮和硝酸盐氮时，还原试剂硫酸联氨也是比较关键的，不同厂家的硫酸联氨质量往往存在差异，纯度不够则导致试剂还原效率偏低，使测定结果准确性降低，经实验筛选建议使用上海展云化工有限公司生产的硫酸联氨。实验用标准溶液应临用现配，所有试剂不用时都应该放冰箱冷藏保存，超过保质期的试剂重新配置，以保证基线的平稳。

（4）在消解测定水中总氮时，润滑剂对测定结果影响较大，常用的润滑剂有十二烷基硫酸钠（SDS）、聚氧乙烯月桂醚、曲拉通。使用SDS 和曲拉通容易导致气泡在加热后破碎，影响基线平稳，经实验筛选建议使用聚氧乙烯月桂醚作为总氮测定中的润滑剂，以避免产生额外的漂移和带过，保证基线的平稳。

（5）温度对显色反应的灵敏度影响很大，化学模块上加热池的温度控制已依据分析方法设定好，使用时直接连接电源即可，切勿自己设定温度或未打开加热池，否则会带来显色反应的灵敏度下降。