80 份紫花苜蓿品种苗期耐盐性筛选与评价

王 宁，万 畅，高 山，闫程铭，李忠和，王俊乔，任 伟，王志锋

（1.吉林省农业科学院 / 中国农业科技东北创新中心, 吉林 长春 130124；2.吉林师范大学生命科学学院, 吉林 四平 136000）

紫花苜蓿(Medicago sativa)是豆科多年生牧草，优质的饲用作物，被誉为“牧草之王”[1-2]。但是土壤盐渍化严重影响紫花苜蓿生长发育及草地畜牧业发展[3]。开展紫花苜蓿耐盐性研究，培育耐盐品种，能够为树立大食物观、构建多元供给体系、保障粮食安全、保护黑土地[4]提供有力科技支撑。

目前关于紫花苜蓿萌发期耐盐性的研究较多，于洁等[5]为探究5 份紫花苜蓿种子萌发期耐盐性强弱，测定紫花苜蓿发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数与幼苗干重等萌发指标，采用主成分分析法、隶属函数法等进行耐盐性评价，结果表明，发芽率与幼苗干重作为紫花苜蓿萌发期耐盐性评价的主要参考指标。李雪等[6]对59 份紫花苜蓿种质资源进行萌发期耐盐性筛选评价，筛选出5 份耐盐性强的紫花苜蓿种质，确定了发芽指数和活力指数为主要耐盐评价指标。张喜斌等[7]对60 份紫花苜蓿品种进行苗期耐盐性评价，利用主成分分析和隶属函数法对过氧化氢酶、过氧化物酶、丙二醛含量等生理指标进行评价，并依据耐盐性度量值筛选出耐盐与敏盐品种。江超[8]通过测定‘印第安苜蓿’‘中苜1 号’‘三得利’和‘敖汉苜蓿’4 个紫花苜蓿品种苗期的保护酶活性、离子含量等生理生化指标，发现丙二醛和保护酶系统对紫花苜蓿耐盐强弱影响较大。但是关于紫花苜蓿苗期表型生物学特征的研究较少。此外，在我国现阶段苜蓿实际产业发展进程中，国外引进品种占比较大，目前对这些国外主推苜蓿品种的耐盐评价研究较少。

因此，本研究采用室内水培盐胁迫的方法，通过测定国外80 份紫花苜蓿品种苗期9 个指标，利用差异性分析、相关性分析、主成分分析、回归分析、聚类分析等方法，开展不同紫花苜蓿品种苗期耐盐性评价，确定主要耐盐指标，划分耐盐等级，筛选耐盐品种，以期为选育耐盐紫花苜蓿新品种及解析耐盐分子调控机制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

80 份引进的紫花苜蓿品种中，包含吉林省农业科学院保存的9 份，北京正道生态科技有限公司的14 份，百绿(天津)国际草业有限公司的17 份，丹麦丹农种子集团的12 份，克劳沃(北京)生态科技有限公司的28 份(表1)。

表1 80 份紫花苜蓿品种来源Table 1 Sources of 80 alfalfa varieties

1.2 试验设计

将80 份紫花苜蓿种子用0.1%升汞消毒10 min，蒸馏水冲洗2～3 次后，分别置于5 层滤纸的培养皿中。将培养皿放于25 ℃恒温培养箱中，培养条件：光照14 h，光照强度5 000 lx，黑暗10 h，相对湿度60%。发芽7 d 后，采用水培法，将每个品种挑选长势一致的10 株幼苗，置于660 mm × 330 mm × 30 mm(长 × 宽 × 高)长方形无孔塑料水培箱中，然后添加Hoagland 营养液(PytoTech，H353)培养，每个水培箱放置10 个品种。试验在吉林省农业科学院草地所气候室进行，温度为22 ℃，每5 d 更换一次营养液。生长35 d 后进行盐胁迫处理，根据前期预试验结果共设置2 个处理：无NaCl 的Hoagland 营养液处理(对照，CK)和含1.2% NaCl 浓度的Hoagland营养液处理(T)，每个处理3 个重复。胁迫处理12d 后取样测量，每次取样3 次重复。

1.3 指标测定及方法

参照《牧草种质资源描述规范和数据标准》[9]，分别测量株高(mm)、根长(mm)、叶片宽度(mm)、叶片厚度(mm)、茎粗(mm)、鲜重(g)、干重(g)，并计算相对组织含水量。

干重：先将鲜样在烘箱中110 ℃杀青20 min后，再将烘箱温度调至80 ℃烘干至恒重。

叶绿素含量：使用叶绿素仪(SPAD-502 Plus，KON-ICA MINOLTA，Japan)测定紫花苜蓿叶片相对叶绿素含量SPAD 值[10]。

1.4 数据分析

用Excel 2010 进行数据整理；使用SPSS 21.0 进行统计分析，分别对不同紫花苜蓿品种两种处理第8 天的9 个指标进行差异性分析、相关性分析、主成分分析、回归分析及聚类分析。

单项耐盐系数(a) = 盐胁迫处理值(T) / 正常苗期处理值(CK)。

综合耐盐系数(B) ：

因子权重系数：

式中：Ci是第i综合指标的贡献率。

各综合指标的隶属函数值[11]：

并将其转换为相应的形式；Xi表示i指标的平均值；Xmax为所有品种的平均数据的最高值；Xmin包 含 多 个 不 同 的 品 种 平 均 最 低 值；i= 1，2，3，…，n。

耐盐性度量值[11](D)：

2 结果与分析

2.1 不同紫花苜蓿品种的耐盐指标测定值分析

对盐胁迫条件下，80 份紫花苜蓿品种的9 个指标进行了测定分析(表2)，正常条件下，80 份紫花苜蓿品种变异系数(coefficient of variation, CV)介于0.064～0.591，说明试验选用的紫花苜蓿品种遗传资源丰富，有良好的代表性，能够满足试验要求。盐胁迫条件下，不同紫花苜蓿品种各指标的变异系数范围介于0.119～0.604，表明盐处理对紫花苜蓿的这些指标产生影响，在不同品种间存在明显差异。不同紫花苜蓿品种的根长、鲜重、干重和相对组织含水量达到极显著差异(P＜ 0.01)，叶宽达显著差异(P＜ 0.05)，说明试验中选取的指标对盐胁迫反应敏感，满足试验要求(表2)。此外，不同紫花苜蓿品种9 个指标的相关系数在0.027～0.840，说明不同指标对盐胁迫的敏感程度不尽相同，采用单一性状指标评价紫花苜蓿的耐盐性缺乏可靠性。

表2 80 份紫花苜蓿品种各指标测量值及差异分析Table 2 Measurement and difference analysis of various indexes of 80 alfalfa varieties

2.2 单项耐盐系数与相关性分析

同一指标的单项耐盐系数(a)值在80 份紫花苜蓿品种间存在明显差异，变异系数介于0.221～0.834 (表3)。同一品种在9 个指标间的a值变化较大，说明各个指标的响应程度不同(表3)。

表3 紫花苜蓿品种萌发指标单项耐盐系数Table 3 Single salt tolerance coefficient for germination indicators of alfalfa varieties

80 份紫花苜蓿品种中，株高与根长、茎粗、鲜重及干重呈显著正相关关系(P＜ 0.05)；叶宽与叶厚呈极显著正相关关系(P＜ 0.01)，系数为0.392；叶厚与鲜重呈显著正相关关系(P＜ 0.05)，叶厚与相对组织含水量呈极显著正相关关系(P＜ 0.01)，系数为0.295；茎粗与鲜重呈显著正相关关系(P＜ 0.05)，与干重呈极显著正相关关系(P＜ 0.01)，系数为0.302；鲜重与叶绿素含量、相对组织含水量呈极显著正相关关系(P＜ 0.01)，系数分别为0.518 和0.347；干重与叶绿素含量呈极显著正相关关系(P＜ 0.01)，系数为0.361 (表4)。结果表明，不同指标间存在一定的相关性，不能准确反映紫花苜蓿品种的耐盐性。

表4 紫花苜蓿品种各指标单项耐盐系数相关性分析Table 4 Correlation analysis of individual salt tolerance coefficients and various indicators of alfalfa varieties

2.3 主成分分析

由80 份紫花苜蓿品种9 个指标的主成分分析结果可知，各因子特征值中前4 个因子(用F1、F2、F3、F4 表示)的累计贡献率达到68.545%，且特征根值大于1，分别为2.398、1.540、1.182、1.049 (表5)。9 个指标转换成4 个相对独立的耐盐指标(用F1、F2、F3、F4 表示)，作为紫花苜蓿盐胁迫的有效成分(表5)。其中，鲜重在F1 主成分中占有较高负荷；相对组织含水量和根长在F2 主成分中占有较高负荷；根长在F3 主成分中占有较高负荷；叶宽在F4 主成分中占有较高负荷(表5)。由此可见，鲜重、相对组织含水量、根长与叶宽可以作为紫花苜蓿苗期耐盐评价的主要指标。

表5 80 份紫花苜蓿品种各指标主成分的特征向量及贡献率Table 5 Characteristic vector and contribution rate of the main components of each index of 80 alfalfa varieties

2.4 不同紫花苜蓿品种苗期的耐盐性评价

80 份紫花苜蓿品种的综合耐盐系数(B)介于0.386～1.343，平均值为0.852，变异系数为0.297 (表6)。依据B 值结果排名，耐盐强的前10 份品种为‘皇后’‘SR4030’ ‘WL168HQ’ ‘WL354HQ’ ‘WL343HQ’ ‘巨能801’ ‘阿迪纳’ ‘阿罗拉’ ‘310SC’ ‘游客’。通过隶属函数计算80 份紫花苜蓿品种的耐盐性度量值(D)得出，D值的范围在0.336～0.639，平均值为0.506，变异系数为0.243。依据D 值结果排名，耐盐强的前10 个品种为‘WL354HQ’ ‘阿罗拉’ ‘巨能801’‘WL343HQ’ ‘CENTRAL’ ‘要 塞’ ‘GIBRALTAR’ ‘巨能7’ ‘皇后’ ‘BLUE MOON’。综合两种评价方法的排序结果可见，耐盐品种为‘WL354HQ’ ‘WL343HQ’‘皇后’ ‘阿罗拉’ ‘巨能801’，两种方法排序结果相一致(表6)。

表6 80 份紫花苜蓿耐盐性隶属函数分析Table 6 Membership function analysis of salt tolerance of 80 alfalfa varieties

2.5 回归分析

根据B值和D值分析结果，对80 份紫花苜蓿品种的耐盐值开展进一步的回归分析。B值各变量的 共 线 性 诊 断 的 膨 胀 因 子(variance inflation factor，VIF)小于5，决定系数R2值在相对组织含水量处达到1.000，9 个指标间没有多重共线性，说明在B值水平上，各变量间不失真。D值各变量的共线性诊断的VIF 值小于5，决定系数R2值在鲜重和相对组织含水量处均达到1.000，表明D值的回归分析中，选取的指标样本优度更高，数据更理想。9 个指标间没有多重共线性，说明在D值水平上，各变量间亦不失真(表7)。进一步结合隶属函数法的分析结果(表6)，B均值变异系数为0.297，D均值变异系数为0.243，变异系数越小，说明代表性越好。综合来看，耐盐性度量值(D)可作为紫花苜蓿耐盐鉴定的适宜方法。

表7 80 份紫花苜蓿品种耐盐性指标的B 值与D 值回归分析Table 7 Regression analysis of B and D values of salt tolerance indicators in 80 alfalfa varieties

2.6 聚类分析与耐盐级别的划分

通过系统聚类分析方法，在欧式平方根距离4.5 处，可以将80 份紫花苜蓿品种分为4 个耐盐级别(图1)。结合耐盐性度量值排序结果，可见，第1 级别为强耐盐级别，包括3 份品种，编号分别为54、83 与136，品 种 为‘WL354HQ’ ‘阿 罗 拉’ ‘巨 能801’，这3 份品种的B值和D值排名也较高(表6)，与上述耐盐性综合评价的结果相一致；第2 级别为较强耐盐级别，包括28 份品种，编号53 与79 的品种为较强耐盐级别；第3 级别为较弱耐盐级别，包括36 份品种；第4 级别为弱盐级别，共13 份品种。

图1 基于80 份紫花苜蓿苜蓿品种耐盐性系统聚类图Figure 1 Family tree based on salt tolerance of 80 alfalfa varieties

3 讨论与结论

3.1 紫花苜蓿品种耐盐指标筛选

植物耐盐强弱是受多重因素控制的综合反应的结果，不同品种间的耐盐机制不同，表型也存在较大差异[12]。因而，用单项指标难以全面准确地反映植物品种的耐盐能力，应用多项指标综合评价植物的耐盐性[13]。张则宇等[4]通过隶属函数和相关性分析、聚类分析对59 份苜蓿种质进行耐盐评价及指标筛选，认为根冠比、叶面积、叶长、茎粗、叶宽、株高、地上生物量、地下生物量和叶绿素含量皆可作为苜蓿耐盐适宜性评价指标。胡亮亮等[14]采用隶属函数分析、综合评价分析与聚类分析对346 份绿豆样本的耐盐性进行了综合评价，表明地上部鲜重、根鲜重、根干重、根长、根体积和根分枝数可以作为绿豆苗期耐盐性评价指标。本研究通过选用株高、叶宽、叶厚、茎粗、根长、鲜重、干重、相对组织含水量及叶绿素含量9 个指标评价紫花苜蓿苗期的耐盐性，结果表明，盐胁迫处理对所有紫花苜蓿品种都有胁迫危害，但不同紫花苜蓿品种间的胁迫抗性存在差异。主成分分析结果将9 个指标转换成4 个彼此独立的综合指标变量，根据各指标占比系数可得，鲜重、根长与叶宽可以作为紫花苜蓿苗期耐盐的主要评价指标，与已有研究结果相一致。

3.2 紫花苜蓿耐盐性评价分析方法的选用

采用多种统计分析方法对植物耐盐性进行评价，是构建更系统、便捷、科学的耐盐评价系统的有效途径。已有研究选用多种分析方法对大豆(Glycine max)[15]、高 粱(Sorghum bicolor)[16]、水 稻(Oryza sativa)[17]、燕麦(Avena sativa)[18]等资源进行了耐盐性评价，发现耐盐性度量值(D)为抗逆性评价的优选指标。刘彤彤等[19]探究40 份小麦品种芽期和苗期的耐盐性，利用D值进行评价，筛选出芽期耐盐型品种9 份，苗期耐盐型品种11 份；芽期和苗期皆耐盐的品种5 份。李雪等[6]探究59 份紫花苜蓿种质萌发期的耐盐性，通过综合耐盐系数(B)和D值进行耐盐性评价，并筛选出5 份耐盐性强的紫花苜蓿种质资源。本研究采用B值、D值对80 份紫花苜蓿品种进行耐盐性排序。其中，根据B值排名结果，耐盐性强的前10 个品种依次为‘皇后’ ‘SR4030’ ‘WL168HQ’ ‘WL354HQ’ ‘WL343HQ’‘巨能801’ ‘阿迪纳’ ‘阿罗拉’ ‘310SC’ ‘游客’。根据D值排名结果，耐盐性强的前10 个品种依次为‘WL354HQ’ ‘阿 罗 拉’ ‘巨 能 801’ ‘WL343HQ’‘CENTRAL’ ‘要 塞’‘GIBRALTAR’ ‘巨 能7’ ‘皇 后’‘BLUE MOON’。两种评价方法中均耐盐的品种为‘WL354HQ’ ‘WL343HQ’ ‘皇 后’ ‘阿 罗 拉’ ‘巨 能801’，结果吻合。通过回归分析结果可知，耐盐性度量值与综合耐盐系数各指标变量间自相关性不明显，说明选取指标合理，结合隶属函数法的分析结果(表6)，耐盐性度量值均值变异系数更小，说明均值对总体的代表性越好，表明耐盐性度量值作为紫花苜蓿苗期耐盐性评价方法更客观、更可靠。

3.3 紫花苜蓿耐盐性筛选与评价

紫花苜蓿耐盐性评价需选择适宜的鉴定指标，耐盐等级划分需选用适宜的评价方法，才能正确客观地反映紫花苜蓿品种的耐盐能力。本研究通过聚类分析，将80 份紫花苜蓿品种划分为4 个耐盐级别，分别为强耐盐级别、较强耐盐级别、较弱耐盐级别和弱耐盐级别，其中编号为54、83 与136 的品种为强耐盐级别，分别为‘WL354HQ’ ‘阿罗拉’ ‘巨能801’。与上述B值和D值的排名结果一致。

综上，盐胁迫显著影响紫花苜蓿苗期的生长。耐盐性度量值为紫花苜蓿耐盐评价的适宜方法。鲜重、相对组织含水量、根长与叶宽可作为紫花苜蓿苗期耐盐评价的主要指标。80 份材料中筛选出苗期耐盐性强的紫花苜蓿品种分别为‘WL354HQ’、‘阿罗拉’与‘巨能801’。