不同生长期香菇培养料中木质纤维素的变化特征

刘丽娜，李顺峰，许方方，崔国梅，高帅平，王安建，田广瑞，魏书信

（河南省农业科学院 农产品加工研究中心，河南 郑州 450002）

香菇（Lentinus edodes）隶属真菌门担子菌亚门层菌纲伞菌目侧耳科，是我国人工栽培最广泛的大宗食用菌种类[1]。香菇是一种典型的木腐菌，其栽培主要以富含木质纤维素的农林业生物质资源为原料，生长过程中可分泌系列降解酶破坏木质纤维素的结构，转化成可吸收利用的小分子物质[2-3]。这种营养模式通过菌类生长达到对木质纤维类生物质的高效、温和处理，在生产美味菌菇的同时，还发挥着重要的生态作用。

木质纤维素类生物质结构复杂，其降解利用对香菇的生长发育至关重要[4-6]。因此，探索木质纤维素的生物降解规律具有十分重要的作用，已成为食用菌生产的热点研究领域之一。目前，仅有少量有关食用菌降解木质纤维素的研究报道，且主要集中在菌株筛选[3，7]、酶学特性[8-9]、营养成分变化[10]、降解机制[11-12]等方面，并没有香菇栽培过程中木质纤维素成分的变化特征的详细报道。鉴于此，以不同生长期的香菇栽培料为研究对象，对香菇栽培过程中木质纤维素含量、纤维素结晶度、傅里叶红外光谱和纤维形态进行研究，旨在阐明香菇栽培过程中培养料木质纤维素的变化特征，为更好地研究香菇对培养料木质纤维素降解利用机制提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试香菇菌株森源19、木屑、麸皮、石灰、石膏由洛阳双惠菌业有限公司提供，培养料配方为木屑78%、麸皮20%、石灰1%、石膏1%，含水量55%。

1.2 试剂与仪器

乙二胺四乙酸钠、四硼酸钠、十六烷基三甲基溴化铵、十二烷基硫酸钠、无水磷酸氢二钠、乙二醇乙醚、冰醋酸、硫酸等均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

仪器主要包括：FA2004C 分析天平（上海越平科学仪器有限公司）、YP30002 电子天平（上海佑科仪器仪表有限公司）、XB-20B 多功能粉碎机（上海兆申科技有限公司）、DF-101S 集热式恒温加热磁力搅拌器（河南省予华仪器有限公司）、Advanced-I艾柯超纯水机（台湾艾柯成都康宁实验专用纯水设备厂）、X-射线衍射仪（荷兰Panalytical Empyrean 公司）、Nicolet is5 型傅里叶变换红外光谱仪（赛默飞世尔科技公司）、OlmpusBX51 光学显微镜（日本OLYMPUS公司）。

1.3 试验方法

将培养料拌匀装袋，塑料袋规格15 cm×55 cm×0.007 cm，袋装料质量（2.2±0.1）kg，装好的料袋放入灭菌锅中100 ℃常压灭菌12 h，当袋温降至28 ℃以下时，按常规无菌操作进行接种。按照河南省地方标准《春栽香菇代料栽培技术规程》[13]（DB41/T 2048—2020）进行香菇的栽培管理。分别在香菇接种前原料（S0）、菌丝满袋（S1）、菌袋转色（S2）、收获一茬菇（S3）、收获二茬菇（S4）5 个时期进行取样。在每个生长期各随机选取6 个不同的栽培袋，将培养料揉碎混匀后作为该时期的代表样品，冻干后粉碎，过0.30 mm筛用于测定。

1.4 测定方法

1.4.1 木质纤维素含量的测定 木质纤维素主要由纤维素、半纤维素和木质素三部分组成。根据VAN SOEST 等[14-15]的方法测定纤维素、半纤维素和木质素含量，其中纤维素和半纤维素含量之和为综纤维素含量。

1.4.2 X-射线衍射分析 取少量干燥后的培养料粉末样品进行X-射线衍射分析[16]，以铜靶为测试靶材，扫描范围为5～50°，扫描速度为5°/min，获得X-射线衍射图。采用Segal 法计算样品纤维素结晶度（Cellulose crystallinity index，CrI），计算公式如下：

式中：CrI表示纤维素结晶度（%）；I002表示纤维素结晶区部分的衍射峰强度；Iam表示纤维素无定形区部分的衍射峰强度。

1.4.3 红外光谱分析 采用李顺峰等[17]的方法取培养料粉末样品，压片后用傅立叶变换红外光谱仪（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）扫描，所得结果用Omnic 8.0软件进行分析。

1.4.4 光学显微成像分析 采用黄慧等[18]的方法使用未粉碎的香菇培养料对其纤维形态进行测定。使用双氧水和冰醋酸（体积比1∶1）混合液制作观察玻片，利用光学显微镜和数码显微成像系统（Mshot digital imaging system V9.0）测量纤维各形态尺寸，在40 倍显微镜下测量纤维长度，在100 倍显微镜下测量纤维宽度。

1.5 数据分析

采用SPSS 22.0 统计软件进行数据分析，LSD方差分析法（P＜0.05）进行统计学分析。

2 结果与分析

2.1 不同生长期香菇培养料的木质纤维素含量

对木质纤维素的生物降解作用，不同香菇菌株间存在着一定差异，香菇降解木质纤维素（纤维素、半纤维素和木质素）的能力比草腐菌强[19]。由表1可知，香菇培养料原料中木质纤维素含量高达85.266%，木质纤维素各组分含量在香菇不同生长期之间均存在显著差异。在香菇栽培过程中木质纤维素各组分含量的变化趋势大体类似，总体上呈现一直下降的趋势。半纤维素与木质素含量在菌丝生长阶段（S1）降解较慢，半纤维素在菌丝满袋（S1）时，比原料（S0）略有增加，这可能是因为半纤维素、木质素的降解速率小于因菌丝呼吸而引起的培养料失重速率。纤维素在菌丝生长阶段（S1）降解了12.92%，生殖生长阶段（S2、S3 和S4）降解了21.81%，说明纤维素生殖生长阶段降解较多。半纤维素、木质素、综纤维素的降解具有明显的阶段性，前期菌丝生长阶段（S1）降解速度较慢，进入转色（S2）后降解速度加快。半纤维素、木质素、综纤维素及纤维素最快降解时期均在一茬菇（S3），该阶段各指标降解百分比达到最大值，分别为30.09%、31.00%、19.10% 和14.76%。二茬菇（S4）与原料（S0）相比，纤维素降解34.73%，半纤维素降解61.58%、木质素降解57.15%、综纤维素降解42.33%；纤维素、半纤维素、木质素、综纤维素含量此时均降到最低，但仍处于较高水平，说明香菇对培养料的降解并不彻底，有必要进一步增加出菇茬数以提高香菇对培养料的利用效率。此外，香菇对半纤维素、木质素的降解率均在55%以上，显著高于纤维素，具有一定的降解优势和选择性，这可能与植物细胞壁的构成有关[20]。

表1 不同生长期香菇培养料的木质纤维素含量Tab.1 Lignocellulosic content in Lentinus edodes culture material during different growth periods %

2.2 不同生长期香菇培养料的纤维素结晶度

纤维素结晶度是指纤维素结晶区占纤维素整体（包括结晶区和无定形区）的百分率，结晶度高则纤维的弹性模量、抗拉强度及尺寸稳定性也高[21]。采用X 射线衍射研究了不同生长期香菇培养料纤维素的结晶特性（图1和表2）。从图1可以看出，原料S0在2θ为14.915°、22.740°、24.392°、38.184°处的衍射峰显示出典型的木质纤维素结晶图谱；经过香菇生长后，14.915°及22.740°处的衍射峰强度明显地持续降低，说明香菇生长对培养料的结晶度影响较大，其结晶区在一定程度上被破坏。其中，纤维素X 射线衍射典型特征002 晶面的结晶度如表2 所示，002 晶面衍射峰的位置介于22.287°～22.857°，香菇生长后无明显改变；菌丝满袋（S1）、菌袋转色（S2）、一茬菇（S3）、二茬菇（S4）的结晶度与原料（S0）相比，其结晶度分别降低22.39%、29.02%、46.91%、61.86%，呈现出原料S0 的纤维素结晶度持续不同程度地减少的变化趋势，说明香菇在生长过程中一直存在对培养料中纤维素晶胞的持续降解作用，该结果与表1中纤维素含量的变化结果一致。此外，不同生长期香菇培养料的衍射曲线均出现一些其余衍射峰，估计跟香菇生长后生成了其他物质如菌丝多糖等有关。

图1 不同生长期香菇培养料的X射线衍射Fig.1 X-ray diffraction of Lentinus edodes culture material during different growth periods

表2 不同生长期香菇培养料的纤维素结晶度Tab.2 Cellulose crystallinity in Lentinus edodes culture material during different growth periods

2.3 不同生长期香菇培养料的木质纤维素红外光谱

利用傅里叶红外光谱分析仪对不同生长期香菇培养料中纤维结构和化学组分进行表征，FTIR 图谱结果见图2。通过参照相关文献[22-26]，确定该图谱中特征峰及归属，分析结果见表3。图2、表3结果表明，香菇不同生长期培养料的傅里叶红外光谱类似，主要吸收峰的位置未发生改变，在波数为1 800～800 cm-1范围内均可以观察到木质纤维素各组分的特征官能团的振动，说明香菇不同生长期培养料中均含有大量的木质纤维素，但特征吸收峰在1 723、1 640、1 510、1 459、1 423、1 383、1 319、1 263、1 157、1 105、1 055、897 cm-1处的振动强度总体呈现减弱趋势，表明随着香菇生长进程的推进，培养料中木质纤维素各组分被降解，对应的红外光谱吸收峰强度随之改变。这与表1中香菇栽培过程对木质纤维素的降解利用规律一致。本研究中，1 510 cm-1处苯环芳香骨架振动是木质素的特征吸收峰；1 723 cm-1处乙酰基和羧基C=O 伸缩振动是半纤维素区别于其他组分的特异吸收峰；1 383、1 157 cm-1处是纤维素和半纤维素特定官能团振动引起；897 cm-1处C-H变形振动是纤维素的特征吸收峰。

图2 不同生长期香菇培养料的FTIR图谱Fig.2 FTIR spectra of Lentinus edodes culture material during different growth periods

表3 不同生长期香菇培养料的红外图谱特征峰Tab.3 FTIR absorption peak location and assignment of Lentinus edodes culture material during different growth periods

纤维素、半纤维素与木质素的特征峰相对强度值可用来判定木质纤维素相对含量的高低[22]。为了进一步明确香菇栽培过程中培养料木质纤维素相对含量的变化，表4列出了纤维素、半纤维素与木质素的特征峰相对强度值。由表4可知，I1723/I1510、I1383/I1510、I1157/I1510、I897/I1510 特征峰比值在香菇不同生长期间存在显著差异。总体来看，随着香菇生长进程的推进，I1723/I1510、I1383/I1510、I1157/I1510 呈现不断减少的趋势，这与纤维素、半纤维素含量的减少有关；而比值I897/I1510 在转色（S2）和一茬菇（S3）呈增大趋势，同时纤维素特征峰峰高却呈降低趋势，表明该生长期香菇木质素相比纤维素有着更快的降解速率。这一结果说明香菇对木质纤维素各组分的降解程度不同，与表1 中不同生长期香菇培养料中木质纤维素各组分的降解利用规律一致。

表4 不同生长期香菇培养料的红外图谱特征峰相对强度Tab.4 Relative intensity of FTIR spectra characteristic peak in Lentinus edodes culture material during different growth periods

2.4 不同生长期香菇培养料的纤维形态

形态特征（纤维长度、纤维宽度等）与培养料中木屑的物理力学性能关系密切[27]，纤维宽度大，纤维间的接触面积就大，木质强度就高。香菇不同生长期的纤维形态如表5 所示，随着香菇生长进程的推进，纤维长度及宽度总体上呈现降低趋势，二茬菇（S4）纤维长度和纤维宽度最小，与其他生长期存在显著性差异；满袋（S1）、转色（S2）的纤维长度与原料（S0）无显著差异，满袋（S1）、转色（S2）、一茬菇（S3）的纤维宽度与原料（S0）无显著差异。这表明香菇栽培过程中对纤维的降解利用是缓慢推进的，栽培料中木质的强度、力学性能随着纤维的降解逐渐下降，最终逐渐失去其固有的形态支撑。

表5 不同生长期香菇培养料的纤维形态特征Tab.5 Fiber morphological characteristics of Lentinus edodes culture material during different growth periods μm

为进一步呈现纤维形态变化，将具有显著差异的二茬菇（S4）与原料（S0）进行光学显微成像分析（×10），结果见图3。经显微镜观察，原料（S0）的纤维壁及内腔表面较为光滑平整，结构致密规整，呈直线形状态；二茬菇（S4）经过香菇生长后纤维壁及内腔遭到破坏，出现较多孔洞、裂纹、粗糙、断裂的现象，及少量膨松状态片状结构。这进一步表明了纤维的降解使得其结构形态发生了变化，与前人[28-29]对秸秆类木质纤维素降解研究的结果相一致。

图3 2种培养料纤维的显微形态Fig.3 Fiber microscopic morphology of two kinds of culture materials

3 结论与讨论

香菇是典型的木腐菌代表，木质纤维素是香菇生长过程中大部分营养的提供源，因此，本研究以不同生长期香菇培养料中木质纤维素的变化特征为切入点，阐明香菇利用基质中木质纤维素的生物降解规律。结果表明，香菇培养料中木质纤维素的含量在不同生长期之间存在显著差异，总体上呈现一直下降的趋势；纤维素在生殖生长阶段（S2、S3和S4）降解较多，半纤维素、木质素、综纤维素的降解具有明显的阶段性，进入转色阶段（S2）后降解速度加快，潘迎捷等[30]、倪新江等[31]的研究中也有相似的结果。木质素很难被直接降解利用，LEATHAM[32]的研究认为，香菇分解木质素的能力较低，其分解木质素需要外源较易利用的碳源；本试验中木质素在菌丝生长阶段降解速度较慢，也佐证了这一点，并与吴学谦等[33]香菇节木栽培基质木质素发菌阶段的降解率较低这一结果相同。有研究报道[34]，纤维素和半纤维素降解最快的时期出现在出菇阶段，而木质素在降解过程中会被优先利用，可能是由于木质素包裹着纤维素同时与半纤维素具有共价关系的结构特点。本试验中，木质素在转色阶段（S2）降解百分比达到23.77%，之后纤维素、半纤维素、综纤维素最快降解时期出现在一茬菇（S3），与前人报道[34]基本一致。二茬菇（S4）与原料（S0）相比，纤维素降解34.73%，半纤维素降解61.58%、木质素降解57.15%、综纤维素降解42.33%，说明半纤维素、木质素在香菇碳素利用中居主要地位，且木质纤维素各组分降解程度高于前人[35]对相同培养料配方及茬数下的F 型菌株的研究报道，这估计是由不同香菇菌株的木质纤维素降解酶体系存在一定差异引起的。

X-射线衍射、红外光谱和纤维形态变化是木质纤维素成分变化的良好反映，可以进一步多角度地反映出木质纤维素的结构变化特征，香菇的栽培过程还缺乏这样的研究。本研究结果显示，不同生长期的香菇培养料均具有典型的纤维素X 射线衍射典型特征及木质纤维素的红外光谱特征官能团的振动。随着香菇生长进程的推进，纤维素典型衍射峰的结晶度持续减少，说明香菇在生长过程中一直存在对培养料中纤维素晶胞的持续降解作用；红外光谱主要吸收峰的位置未发生改变，木质纤维素各组分的特征官能团的振动强度总体呈现减弱趋势，与木质纤维素各组分的降解利用规律一致；特征峰比值I1723/I1510、I1383/I1510、I1157/I1510 不断减少，而I897/I1510 在转色（S2）和一茬菇（S3）呈增大趋势，同时纤维素特征峰峰高却呈降低趋势，表明该生长期香菇木质素相比纤维素有着更快的降解速率。纤维长度及宽度总体上呈现降低趋势，二茬菇（S4）纤维长度及宽度最小，与其他生长期存在显著性差异。经显微镜观察，二茬菇（S4）时，经过香菇生长后，培养料纤维壁及内腔遭到破坏，出现较多孔洞、裂纹、粗糙、断裂的现象，及少量膨松状态片状结构，明显区别于原料（S0）的光滑平整、结构致密规整，这进一步表明了纤维的降解使得其结构发生变化。经过二茬菇生长后香菇培养料中木质纤维素仍处于较高水平，生物质资源利用并不彻底，对其更高程度的转化利用方式还有待于进一步深入研究。

综上，栽培过程中香菇对培养料木质纤维素具有较强的持续的降解作用，可显著降低木质纤维素含量，破坏纤维素结晶区，使得红外光谱吸收峰及纤维形态发生改变。