H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白在水稻胚乳中的表达及其纯化

屈小天，王雅楠，许倩茹，李雪洋，张申立，张二芹，张改平，4

（1.河南农业大学 生命科学学院，河南 郑州450046；2.吉林大学 动物医学院，吉林 长春130062；3.河南农业大学 动物医学院/国家动物免疫学国际联合研究中心，河南 郑州450046；4.河南省农业科学院 动物免疫学重点实验室，河南 郑州450002）

H5N1 亚型禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）是一种单股负链RNA 病毒，属于RNA 病毒的正黏病毒科。H5N1 AIV 引起高致病性传染病，传播途径是禽类之间的接触和飞沫传播，有时也可能通过污染的水源传播。H5N1 AIV 主要以家禽类和野生鸟类为宿主，也有少数情况下感染人类并引起严重病症，但并不会在人和人之间传播。H5N1 AIV在全世界范围的广泛传播，严重危害了畜牧养殖产业经济和公共卫生安全[1-2]。做好生物安全防护和接种疫苗是预防和治疗AIV 的主要手段，研发更加稳定高效的H5亚型禽流感疫苗是非常重要的。

H5N1 AIV 由8个不同的基因片段组成，这些基因可编码10 种不同的结构蛋白和非结构蛋白[3-4]。结构蛋白有外层的神经氨酸酶（NA）、血凝素（HA），内部的基质蛋白M2 和M1、核蛋白（NP），及酸性聚合酶（PA）和碱性聚合酶1（PB1）、碱性聚合酶2（PB2）3 种聚合酶，非结构蛋白有NS1 和NS2。HA蛋白是H5N1亚型禽流感病毒表面最主要囊膜糖蛋白，呈棒状纤突，以三聚体（HA0、HA1、HA2）形式存在，在病毒的宿主特异性、吸附、穿膜和致病力中都发挥着重要作用[5]，是研究H5 亚型禽流感疫苗的重要靶蛋白[6]，对于研制更加高效H5 亚型禽流感亚单位疫苗具有重要意义。

目前，临床上广泛使用H5 亚型禽流感的灭活疫苗和减毒活疫苗来预防和治疗H5N1 亚型禽流感，效果良好。但是灭活疫苗没有交叉保护作用，同时在制备过程中需要鸡胚多次传代导致生产效率较低、成本高，无法应对突发性的禽流感大流行[7]。减毒活疫苗存在着接种方式受限、成本高和强毒苗安全性低等问题，只适用于在免疫系统较强的人群中应用[8]。相较于灭活疫苗和减毒活疫苗，亚单位疫苗具有安全性高和抗原特异性高等优点。科研人员已经在多种表达系统中成功表达了HA 蛋白，如大肠杆菌[9]、昆虫细胞[10]、乳酸杆菌[11]和毕赤酵母[12]等。但由于重组HA 蛋白的免疫原性和稳定性等问题，限制了这些表达系统在临床中的应用[13]。水稻被认为是一种安全高效的分子生物反应器，其生长快和生长期短，而且在体外培养条件下易于大规模培养和管理。水稻细胞壁比较薄，细胞质基质中含有较低的蛋白酶活性，这使得水稻易于实现高效的外源蛋白表达。水稻作为真核表达系统，能够对重组HA 蛋白进行正确的翻译、折叠和修饰；并且植物自身携带的植物性病毒和微生物不会对人与动物造成危害[14-15]。使用水稻胚乳表达H5 亚型重组HA 蛋白具有非常高的安全性，而且生产成本低和容易规模化生产[16-17]。为此，利用水稻胚乳表达体系的优点，构建H5N1 AIV 重组HA 蛋白的稳定表达体系，并对重组HA 蛋白进行了分离纯化和免疫原性评估，以期为后续H5N1 AIV 诊断试剂的研发和亚单位疫苗的制备奠定基础。

1 材料和方法

1.1 基因、载体、主要试剂及供试动物

pUC57-HA由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；中间载体pMP3、植物表达载体pCAMBIA-1300和EHA105农杆菌感受态由武汉禾元生物科技股份有限公司提供；大肠杆菌DH5α 菌株、DL1500 Marker和GeneRuler 1 kb DNA Marker购自大连宝生生物公司；MlyⅠ、XhoⅠ、NaeⅠ、EcoR Ⅰ和HindⅢ内切酶购自NEB（英国）公司；阴离子Q 填料购自TOSOH（日本）公司；疏水Butyl填料、75 pg凝胶过滤纯化柱购自GE（美国）公司；蛋白质分子质量标准购自Thermo（美国）公司；超敏ECL 化学发光试剂盒（250 mL）购自苏州新赛美生物科技有限公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗鼠IgG购自Abbkine公司；H5N1 A/goose/Guangdong/1/1996株、H5灭活苗阳性血清保存于国家动物免疫学国际联合中心；4周龄Balb/c小鼠购自郑州市实验动物中心。

1.2 重组载体pMP3-HA和pCAMBIA1300-HA的构建

由南京金斯瑞公司合成重组质粒pUC57-HA，用限制性核酸内切酶MlyⅠ和XhoⅠ双酶切重组质粒pUC57-HA，回收HA 片段，用限制性核酸内切酶NaeⅠ和XhoⅠ双酶切pMP3 中间载体，回收pMP3片段，将HA 和pMP3 连接后获得中间载体pMP3-HA。将其转化到大肠杆菌DH5α 中，挑白斑菌落，使用LB 液体培养（卡那霉素50 μg/mL）。用AXYEGN 试剂盒提取重组质粒pMP3-HA，双酶切（EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ）和PCR 鉴定后，送至武汉擎科生物有限公司测序。使用限制性核酸内切酶EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切pCAMBIA1300，连接HA与pCAMBIA1300，并转化到DH5α 中，挑白斑菌落，使用LB 液体培养（卡那霉素50 μg/mL），对重组质粒pCAMBIA1300-HA进行双 酶切（EcoR Ⅰ和HindⅢ）和PCR鉴定。

1.3 水稻遗传转化及重组HA蛋白表达鉴定

1.3.1 水稻遗传转化 将重组质粒pCAMBIA1300-HA通过电转化方法转化到EHA105 农杆菌中，并用PCR 方法筛选阳性菌。用阳性根瘤农杆菌EHA105侵染培养8 d左右的TP309胚乳愈伤组织，经过暗培养、潮霉素筛选、愈伤分化、生根、成苗。利用CTAB法提取水稻叶片的DNA，利用HA引物（表1）进行PCR 扩增鉴定。最后将筛选到的阳性植株种植到大田中，4个月后收获水稻种子。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.3.2 重组HA 蛋白鉴定 收获不同株系的水稻种子，研磨成粉末，加入HA 蛋白提取液（30 mmol/L Tris-HCl，pH 值7.5），室温下搅拌1.5 h，4 ℃离心机12 000 r/min 离心15 min，取上清。以H5 灭活苗阳性血清为一抗，HRP 标记的山羊抗鼠抗体为二抗，Western blot鉴定各个植株HA蛋白的表达量。

1.4 重组HA蛋白的纯化

1.4.1 蛋白质提取液的筛选 将1.3.2 中HA 蛋白表达量高的水稻种子脱壳，研磨成粉，分别与不同提取溶液（表2）按照质量体积比（m/V）1∶5的比例混合，室温下搅拌提取1.5 h，4 ℃离心机12 000 r/min离心15 min，弃沉淀，上清经0.22 μm 滤膜过滤，作为HA 蛋白的粗提液。Western blot 筛选最佳的HA蛋白提取液。

表2 不同的提取缓冲液信息Tab.2 Different extraction buffers

1.4.2 纯化方法的组合 摸索不同层析组合方式，最终确立了三步纯化方法，首先使用50 mL TOSOH Q 填料对重组HA 蛋白粗提液进行初步分离纯化，收集7%洗脱液，进行25%硫酸铵沉淀。硫酸铵沉淀上清液使用10 mL Butyl 填料进一步分离纯化，收集100%洗脱液。采用pH 值7.5 的30 mmol/L Tris-HCl缓冲液对100%洗脱液进行浓缩换液后，用凝胶过滤层析柱进行最终纯化。将蛋白质粗提液与所有流穿液和洗脱液进行SDS-PAGE 和Western blot鉴定，评估目的蛋白纯度。

1.5 重组HA蛋白的免疫评价

1.5.1 免疫程序 将纯化的重组HA 蛋白与ISA 50V 佐剂按照1∶1（m/V）混合并乳化制备成疫苗，以20 μg/只皮下多点注射法免疫3只Balb/c小鼠作为试验组；以200 μL PBS 皮下多点注射法免疫3只Balb/c 小鼠作为阴性对照组。首次免疫14 d 后加强免疫一次。加强免疫14 d 后眼眶静脉丛采血，分离血清。

1.5.2 特异性抗体检测 使用间接ELISA 法测定免疫小鼠的特异性抗体产生水平，将待检测血清和阴性血清从1∶1 000 倍比稀释到1∶128 000，分别加入纯化的重组HA 蛋白抗原包被的微孔中，每组样品重复3 次，37 ℃孵育1 h，每孔加入150 μL PBST洗涤5 次；每孔加入50 μL 酶标二抗，37 ℃孵育1 h，每孔加入150 μL PBST 洗涤5 次；加入显色液避光作用15 min，加入终止液，酶标仪以450 nm 波长进行读数（OD450），待检测血清OD450值（P）大于阴性血清OD450值（N）2.1倍时判定为阳性。

2 结果与分析

2.1 重组载体pMP3-HA和pCAMBIA1300-HA的鉴定

用MlyⅠ和XhoⅠ双酶切重组质粒载体pUC57-HA后，HA基因大小为3 175 bp（图1A）。将回收的HA基因和载体pMP3 连接，构建重组中间载体PMP3-HA，转化到大肠杆菌DH5α 中，使用EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切鉴定HA基因的大小为4 660 bp（图1B）。将回收的HA基因与载体pCAMBIA1300连接，构建重组植物表达载体PCAMBIA1300-HA并转化到DH5α 中，使用EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切鉴定，HA基因的大小为4 660 bp（图1C），与预期大小一致。

图1 重组载体pUC57-HA（A）、pMP3-HA（B）和pCAMIBIA1300-HA（C）酶切鉴定Fig.1 Enzyme digestion identification of recombinant vectors pUC57-HA（A），pMP3-HA（B）and pCAMIBIA1300-HA（C）

2.2 HA基因阳性植株的筛选

采用CTAB 法提取水稻叶片的DNA，经PCR 扩增鉴定，结果显示，在75 株水稻中筛选到58 株阳性植株，HA基因扩增大小为608 bp，图2 为部分植株的PCR 鉴定结果，表明HA基因已成功整合到水稻基因组中。

图2 HA基因阳性植株PCR鉴定Fig.2 PCR identification of HA gene positive plants

2.3 HA蛋白表达的鉴定

挑选11 个株系的水稻种子，经研磨、提取液提取后，进行Western blot鉴定。结果显示，HA蛋白大小约为140 ku（图3），与预期结果一致，表明HA基因在水稻胚乳中成功地表达，即成功构建了H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白的水稻胚乳表达系统。

图3 重组HA蛋白Western blot鉴定Fig.3 Western blot identification of recombinant HA protein

2.4 重组HA蛋白的纯化

2.4.1 蛋白质提取液的筛选 根据重组HA 蛋白特性和水稻胚乳蛋白特性，筛选能够最大程度溶解重组HA 蛋白的提取液，Western blot 结果如图4 所示，6、7和8三种蛋白质提取液溶解的HA蛋白较多。最终确定，以6 号蛋白质提取液（50 mmol/L Tris，1 mmol/L EDTA，pH值7.5）作为重组HA蛋白提取液。

2.4.2 纯化方法的效果 第一步使用阴离子层析分离纯化重组HA 蛋白，填料为Q，SDS-PAGE（图5A）和Western blot（图5B）表明，在使用Q 柱层析分离纯化后，重组HA 蛋白在7%洗脱液中，相较于重组HA 蛋白粗提液，重组HA 蛋白得到了富集，并除去了大部分杂蛋白（流穿液和100%洗脱液均为去除的杂蛋白）。

图5 HA蛋白Q阴离子层析SDS-PAGE（A）和Western blot（B）鉴定Fig.5 HA protein Q anion chromatography identified by SDS-PAGE（A）and Western blot（B）

第二步分离纯化重组HA 蛋白的方法为疏水层析。SDS-PAGE（图6A）和Western blot（图6B）鉴定结果显示，重组HA 蛋白在100%洗脱液中，相较于第一步分离纯化，重组HA 蛋白得到进一步的富集和纯化，去除了较多的杂蛋白（流穿液和60%洗脱液均为去除的杂蛋白）。

图6 HA蛋白疏水层析SDS-PAGE（A）和Western blot（B）鉴定Fig.6 HA protein hydrophobic chromatography identified by SDS-PAGE（A）and Western blot（B）

最后是凝胶过滤层析分离纯化HA 蛋白，以达到最终的纯化效果，SDS-PAGE（图7A）和Western blot（图7B）的检测可知，HA 蛋白在流穿液2 中，Quantity One 软件分析重组HA 蛋白纯度达到90%以上，达到目的纯度。

图7 HA蛋白凝胶过滤层析SDS-PAGE（A）和Western blot（B）鉴定Fig.7 HA protein gel filtration chromatography identified by SDS-PAGE（A）and Western blot（B）

2.5 重组HA蛋白的免疫评估

加强免疫14 d 后采集并分离小鼠血清，间接ELISA 法检测小鼠血清抗体水平。从图8 可以看出，3 只小鼠血清的抗体效价都达到1∶128 000 以上，具有较高的抗体水平，表明重组HA 蛋白具有很好的免疫原性。

图8 小鼠血清抗体水平测定结果Fig.8 Measurement of serum antibody levels in mice

3 结论与讨论

H5N1 亚型禽流感是甲型流感病毒引起的急性和高接触性传染病，自1996 年首次分离出H5N1 亚型禽流感病毒以来，该病毒在许多国家和地区出现，主要分布在亚洲、非洲和欧洲，严重危害着养殖业和公共卫生安全，研发更加安全高效的疫苗便显得十分重要。HA 蛋白是禽流感表面最主要囊膜糖蛋白，能够诱导产生中和抗体，是研究禽流感疫苗的重要靶蛋白[18-20]。SĄCZYŃSKA 等[21]在大肠杆菌中表达了H5N1 AIV 重组HA 蛋白rH5-E.coli，但原核表达系统在其表达过程中不一定能够正确地翻译后修饰，特别是糖基化修饰，从而无法保证其生物学功能，rH5-E.coli作为抗原进行免疫不具有免疫持久性。TANG 等[22]利用昆虫细胞成功表达了H5N1 AIV 重组HA 蛋白，但表达量较低，稳定细胞系建立难度较大，成本较高，无法满足疫苗生产时大规模生产蛋白质的需要。

本研究采用不含His标签、不含生物毒性、具备糖基化修饰、安全性高且同时具备容易培养、成本低廉等优势的转基因水稻来表达重组HA 蛋白。水稻作为植物表达系统的主要宿主之一，广泛应用于生产重组蛋白[23]、抗体[24-25]和制备疫苗[26]等方面。水稻生长快、生长期短，而且在体外培养条件下易于大规模培养和管理，同时在水稻基因组中存在一些高效的启动子和转录因子元件，如OsAct1、OsUbiquitin 和OsUbi-1 等元件，这些元件有利于构建和优化水稻表达载体。目前，已有H9 亚型禽流感病毒HA蛋白、新城疫病毒HN蛋白和狂犬病病毒G 蛋白等在水稻中成功表达，表达出的蛋白质具有遗传稳定、表达高效和免疫原性好等优点[27]。可见，水稻是一种很好的植物生物反应器[28]。但其在使用过程中，后期的分离纯化是一个难题。重组HA 蛋白经过分离纯化后才能被应用，但是重组HA 蛋白的纯化成本高昂，占总成本的60%～80%[29]。由于目的蛋白自身的复杂性和来源的多样性，导致目前尚未能够建立起一种通用的蛋白质分离纯化技术。常用的蛋白质分离纯化方法包括离子交换层析、等电点沉淀法、疏水层析、亲和层析和凝胶过滤层析等[30]。Ni 离子亲和层析是实验室最常用的蛋白质分离纯化方法，但是由于添加了His标签，有可能影响蛋白质构象，同时Ni 离子亲和层析填料成本高，导致难以应用于工业化生产。疏水填料和离子填料可以多次重复使用并且蛋白质结合载量高，常常被用作批量化生产。

本试验以HA 蛋白为研究对象，前期研究确定了最佳的色谱填料后，还需进一步研究pH 值、离子强度等与填料相互作用的最优条件。利用梯度洗脱法，逐级筛选出适宜的离子强度，使重组HA 蛋白与填料之间的相互作用最大化，并降低杂质蛋白质与填料之间的相互作用，从而达到最佳的分离效果。单一的疏水相互作用层析或离子交换层析很难获得较好的分离效果，故本研究将2 个填料结合应用于目的蛋白的分离纯化。在此基础上，本研究采用3个步骤，先后使用Q 阴离子交换色谱、疏水色谱和凝胶过滤色谱分离纯化重组HA 蛋白的纯化方法，通过SDS-PAGE 和Western blot 检测重组HA 蛋白的纯化效果，可以直观观测到去除的杂蛋白含量和目的蛋白位置，重组HA 蛋白纯度纯化到90%以上。以重组HA 蛋白为抗原制备亚单位疫苗，生产工艺简单、易于大规模生产且生物安全性高，弥补了灭活疫苗和减毒活疫苗的缺点，是开发H5N1 亚型禽流感亚单位疫苗的一个重要方向。因此，本研究利用纯化的重组HA 蛋白与ISA 50V 混合并乳化制备成亚单位疫苗，免疫小鼠，二免2周后小鼠血清抗体水平ELISA 效价达到1∶128 000 以上，表明重组HA蛋白具有较好的免疫原性。

综上所述，本研究成功构建了能够稳定表达H5N1 亚型禽流感病毒HA 蛋白的水稻胚乳表达系统，并使用三步分离纯化方法获得了纯度为90%以上的重组HA蛋白，对重组HA蛋白免疫原性进行了评估，为H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白的功能研究和亚单位疫苗的研发奠定基础。