甜菜酪氨酸代谢途径关键酶的生物信息学研究

杨家琪，韩广源，刘乃新，周芹

（1黑龙江大学现代农业与生态环境学院，哈尔滨 150080；2哈尔滨海关技术中心，哈尔滨 150023）

0 引言

酪氨酸代谢途径是植物产生多种天然化合物的起点，如大豆中的生育酚[1]、甜菜中的甜菜碱[2]、黄连中的苄基异喹啉生物碱[3]、红景天中的红景天苷[4]、秋水仙中的秋水仙碱[5]等。其中，酪氨酸代谢产物生育酚、质体醌、泛素是所有生物体中蛋白质合成所必需的芳香族氨基酸，对于植物的生长发育具有至关重要的作用，然而，它只存在于植物、细菌和真菌中[6]。除了蛋白质的合成之外，植物利用酪氨酸的代谢能够产生具有不同特性的代谢物，如生育酚具有耐逆性[7]、甜菜碱能够吸引传粉者进行授粉[8]。据相关研究报道，酪氨酸代谢途径的衍生化合物可以用作镇痛药（吗啡）[9]、紫外线保护剂（黑色素）、抗氧化剂（维生素E）[10]等。

甜菜(BetavulgarisL.)属于藜科甜菜属二年生草本植物，是全球重要的糖料作物之一，每年有20%～30%的糖产自于甜菜[11]，其具有耐寒、耐盐碱、抗旱和喜温的特性，广泛种植于中国的黑龙江、新疆和内蒙古地区。甜菜不仅是食品工业的原材料，还是医药工业的重要原材料（例如治疗帕金森病药品（L-二羟基苯丙氨酸）的底物[12]）。甜菜中的甜菜碱是一种由甜菜胺酸合成酪氨酸衍生物[13]，在天然植物中，作为活性氧(ROS)的清除者，能够保护植物免受细菌渗透造成的损害[14]；在人体中，具有对抗肿瘤、降脂保肝、保胃治肝、降低血压的功能[15]；甜菜素又称“甜菜花青素”是一种由L-酪氨酸衍生的水溶性含氮色素，对于植物颜色（黄、红、紫）变化具有重要的作用[16]，并且其消炎能力和抗氧化性对人体健康有积极的影响[17]。因此，了解甜菜的酪氨酸代谢途径有可能提高酪氨酸和对人体有益的酪氨酸衍生物的产量。尽管甜菜对人体有很多益处，但是目前关于甜菜在酪氨酸代谢途径中对人体有益衍生物的研究主要集中于甜菜碱和甜菜素两个方面[14]，其他酪氨酸衍生物鲜少有报导。为了了解甜菜酪氨酸代谢途径中更多的有益酪氨酸衍生物，本研究以酪氨酸代谢途径为研究背景，基于NCBI数据，利用生物学信息的方法对甜菜酪氨酸代谢中五种关键酶进行了比较分析，该研究为探索甜菜酪氨酸代谢途径关键酶功能研究提供参考，为进一步研究甜菜基因组学奠定基础。

1 材料与方法

通过查询相关资料[18]了解到酪氨酸代谢途径和5种关键酶(PPO、TAT、TYDC、HPPD、HPPR)，从NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中获得关键酶的氨基酸序列，利用在线软件ExPASy- ProtParam(expasy.org/ protparam/)分析甜菜酪氨酸代谢途径中关键酶的理化性质，再使用MEGA-7软件将各个植物的同一种酶蛋白氨基酸序列间的相似性及演化距离进行对比，并且构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 序列检索及理化性质分析

2.1.1 多酚氧化酶(PPO) 多酚氧化酶参与植物的光合作用、生物合成及褐化等过程，特别是在酶促褐变过程中，多酚氧化酶具有关键性作用[19]。本研究在NCBI上下载了10 种植物的多酚氧化酶(PPO)氨基酸序列信息，使用ExPASy-ProtParam软件对目标蛋白酶的理化性质进行了分析，所得结果如表1所示。

表1 不同植物PPO的序列号及理化性质

分析10种植物的PPO氨基酸数约含400～700个；相对分子质量约为50.0k～160.0 kDa。等电点的范围在4.68～7.20 之间，整体的酸碱度为中性偏酸性分布。10种植物的PPO稳定性存在差异，马铃薯和芝麻的稳定性较强，而其他8 种植物的稳定性较弱。相对平均亲水性皆为亲水性蛋白（表1）。

2.1.2 酪氨酸氨基转移酶(TAT) 酪氨酸氨基转移酶是合成维生素E 的一个关键酶，维生素E 的含量与酪氨酸氨基转移酶呈正相关[20]。

分析10 种植物的TAT 氨基酸数约含400～430 个；相对分子质量约为45.0k～48.0 kDa。等电点的范围在5.04～5.96之间，整体的酸碱度为酸性分布。10种植物的TAT稳定性存在差异，甜菜、彩叶草、欧洲油菜和荠菜的稳定性较弱，而其他6 种植物的稳定性较强。只有甜菜和辣椒的相对亲水性为亲水性蛋白，其他8 种植物均为疏水性蛋白（表2）。

表2 不同植物TAT的序列号及理化性质

2.1.3 酪氨酸脱羧酶(TYDC) 酪氨酸脱羧酶是秋水仙碱合成的关键酶[21]。分析10种植物的TYDC氨基酸数约含100～530个；相对分子质量约为13.0 k～57.0 kDa。等电点的范围在4.80～7.56之间，整体的酸碱度为酸性分布，只有大豆为弱碱性。10种植物的TYDC稳定性存在差异，拟南芥、大豆和荠菜的稳定性较强，其他6种植物的稳定性较弱。相对平均亲水性中马铃薯、花生、大豆为疏水性蛋白，其他7种植物均为亲水性蛋白（表3）。

表3 不同植物TYDC的序列号及理化性质

2.1.4 对羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD) 对羟基苯丙酮酸双加氧酶能够直接影响质体醌和生育酚的合成，从而影响植物的生长发育[22]。分析10种植物的HPPD氨基酸数约含400～500 个；相对分子质量约为46.0k～50.0 kDa。等电点的范围在4.31～5.97 之间，整体的酸碱度为酸性分布。10 种植物的HPPD 稳定性存在差异，大麦的稳定性较强，其他9 种植物稳定性均较弱。相对平均亲水性均为亲水蛋白（表4）。

表4 不同植物HPPD的序列号及理化性质

2.1.5 羟苯基丙酮酸还原酶(HPPR) 迷迭香酸(RA)及其衍生物具有促进身体健康的特性[18]，例如保护心脏、抗氧化、抗菌等，而羟苯基丙酮酸还原酶是合成RA的关键酶。分析10 种植物的HPPR 氨基酸数约含300～500个；相对分子质量约为33.0k～52.0 kDa。等电点的范围在5.26～8.70之间，整体的酸碱度为中性偏碱性分布。10 种植物的HPPR 稳定性存在差异，玉米、高粱、花生、辣椒、藜麦、大麦的稳定性较强，甜菜、水稻、芝麻、大豆的稳定性较弱。相对平均亲水性方面甜菜、芝麻、大豆均为亲水蛋白，其他6种植物均为疏水性蛋白（表5）。

表5 不同植物HPPR的序列号及理化性质

2.2 系统发生分析

2.2.1 多酚氧化酶（PPO）由图1 可知，甜菜与菠菜的PPO 亲缘关系最近，表明它们在酪氨酸合成代谢途径中的作用可能相似度较高。从PPO 蛋白系统发育树可以发现高梁和花生位于系统发育树的最外围，它们与其他8 种植物PPO 亲缘关系最远，表明这两种植物与甜菜的PPO的结构和功能可能存在较大的差异。

图1 10种植物PPO蛋白的系统发育树

2.2.2 酪氨酸氨基转移酶(TAT) 由图2可知，甜菜与大豆的TAT亲缘关系最近，其次是玉米、荠菜，它们的分支长度和遗传距离较为相近，表明它们在酪氨酸合成代谢途径中可能具有相似的作用。

图2 10种植物TAT蛋白的系统发育树

2.2.3 酪氨酸脱羧酶(TYDC) 由图3可知，甜菜与马铃薯的TYDC 亲缘关系最近，表明它们在酪氨酸合成代谢途径中TYDC分子可能具有相似的结构和功能。因此，研究该代谢途径的TYDC 时可以将甜菜与马铃薯进行比较。

图3 10种植物TYDC蛋白的系统发育树

2.2.4 对羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD) 由图4 可知，甜菜与菠菜的HPPD 亲缘关系最近，其次是欧洲油菜；而玉米单独形成一组，与其他9 种植物没有亲缘关系稍微相近的分子，表明在酪氨酸合成代谢途径中甜菜与玉米的HPPD 结构、功能可能存在较大的差异。

图4 10种植物HPPD蛋白的系统发育树

2.2.5 羟苯基丙酮酸还原酶(HPPR) 由图5 可知，甜菜与大麦的HPPR 亲缘关系最近，这两种植物的遗传距离和分支长度相似，表明它们在酪氨酸合成代谢途径中可能具有较高的相似性。

图5 10种植物HPPR蛋白的系统发育树

3 讨论

近几十年来，人们对甜菜的酪氨酸代谢途径的生物合成及其相关酶和基因进行了广泛的研究，使人们对这类代谢途径的认识和利用取得了一些进展。对于甜菜等不同植物酪氨酸代谢途径中的PPO、TAT、TYDC、HPPD、HPPR 的理化性质分析表明，不同的蛋白质分子构建的系统发育树不能在不同的植物之间产生相同的进化关系。例如，甜菜与马铃薯的TYDC 进化关系最近，而它们的分子进化关系存在较大的差异。相同的代谢途径下，不同的植物产生代谢物（酪氨酸）的含量也可能存在差异，因此关键酶的表达和序列的差异都可能影响代谢物的产生。

多酚氧化酶(PPO)广泛分布于植物界，在大部分的蔬菜和水果中都已被检测到。在植物中，PPO 主要位于叶绿体的类囊体膜上，是蔬菜、水果酶促褐变和黑色素合成的关键酶[23]。蔬菜、水果发生酶促褐变，容易引起产品水分、风味、色泽等变化，降低其经济价值和营养价值。根据PRECZENHAK 等[24]研究报道，甜菜碱由于具有较强的ROS清除剂能力和高抗氧化能力，能够延缓蔬菜、水果的酶促褐变，保持该产品的社会价值，被认为是最重要的抗自由基化合物，而PPO 催化酪氨酸的羟化反应和多巴的氧化反应是甜菜碱合成的前提[25]，因此，甜菜在甜菜碱的作用下能够保持较高的经济价值和营养价值。

酶酪氨酸脱羧酶(TYDC)是一种依赖吡哆醛-5'-磷酸(PLP)的芳香氨基酸脱羧酶，能够催化L-酪氨酸(TYR)脱羧生成酪胺，酪胺对生物碱的形成具有重要的作用[26]，甜菜碱属于生物碱的一种。根据彭静叶对大花红景天的研究表明提高TYDC的数量表达能够有效的提高植物中红景天苷的含量，从而增强植物的药用价值[27]。目前，国内外关于酶酪氨酸脱羧酶对甜菜的生长发育和营养价值影响的报道尚未发现，在甜菜中提高TYDC的数量是否也能增强该植物的药用价值还有待进行深入的研究。

羟苯丙酮酸还原酶(HPPR)能够催化4-羟苯丙酮酸(pHPP)还原为4-羟苯乳酸(pHPL)，是酪氨酸生物合成迷迭香酸(RA)的关键酶[28]。根据郭宇等[29]对紫苏HPPR 基因扩增发现各种植物激素的响应元件在HPPR启动子中存在，而激素能够控制植物的生长、发育和抗逆能力。甜菜具有耐寒、耐旱等优良的特性能够在恶劣环境下种植，但是逆境胁迫（高温、极度干旱等）会严重影响作物的生长发育，导致作物产量和品质的下降。通过调节甜菜HPPR基因表达可以提高甜菜的抗逆能力，虽然甜菜在这一方面的研究报道并未发现，但为今后的研究提供了一个研究思路。

甜菜体内营养成分丰富多样，不仅含有丰富的可溶性糖，还含有维生素E。维生素E，又名生育酚，是一种人体所必需的植物源性脂溶性维生素，仅在高等植物和其他产氧光养生物中合成，人体不能合成，必须从饮食中获得[30]。在植物中，维生素E 能够消除光合器官中自由基的数量，抵御脂肪氧化酶对脂类双层膜的攻击，保护生物膜和光合器官的完整性[31]。酪氨酸氨基转移酶(TAT)和对羟基苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD)是合成维生素E 的关键酶，JON 等[32]研究发现烟草中HPPD 的过量表达能够增加烟草种子维生素E的含量，同时SANDORF 等[20]也发现增加TAT 的表达可以相应地提高维生素E 的含量。总的来说，修改HPPD 和TAT 基因表达可以调节植物组织中维生素E的含量。

本研究的不足之处在于选择植物种类时，没有考虑将相同物种的5 种关键酶进行比较，削弱了不同植物酪氨酸代谢途径的可比性。这是因为并不是所有的植物在酪氨酸代谢方面都拥有一个完整的代谢途径，或者某一些植物在PPO、TAT、TYDC、HPPD、HPPR 方面还未被测序研究。因此，在研究酪氨酸代谢途径时，可以将同时拥有相同关键酶且关键酶的遗传距离较近的不同植物进行对比，能够帮助人们进一步了解酪氨酸代谢途径的细节。

4 结论

从10种植物酪氨酸代谢途径5种关键酶的理化性质分析表明，甜菜在酪氨酸代谢途径中的5 种关键催化酶均为不稳定的亲水性蛋白质；甜菜中TAT、PPD、HPPR等电点为偏酸性，TYDC 和PPO等电点为中性；相对分子质量和氨基酸数均存在差异性。序列相似性分析结果表明：在PPO和HPPD方面，甜菜和菠菜的亲缘关系最近，各项基础性质相近，在研究甜菜酪氨酸代谢途径中PPO 和HPPD 方面，可以将菠菜作为参考植物。在TAT、TYDC、HPPR方面，甜菜与大豆、马铃薯、大麦的亲缘关系最近，但是在理化性质方面存在较大的差异，因此，在研究甜菜酪氨酸代谢途径中TAT、TYDC、HPPR 方面，建议寻找其他植物作为参考物或者采用其他方法研究这三种酶。