老年带状疱疹急性期METTL3及Gal-3表达水平对带状疱疹后遗神经痛的预测价值

张玉林 方启帆 赵永明 吴泽宇 杨颖

带状疱疹(herpes zoster, HZ)是水痘-带状疱疹病毒感染侵犯神经节和皮肤引起的急性疱疹性皮肤病[1]。HZ治疗后虽然疱疹已经消失,但感觉神经支配区疼痛可持续存在,对于持续3个月以上的疼痛即发展为带状疱疹后遗神经痛(postherpetic neuralgia, PHN),严重影响病人的生活质量[2]。深入研究老年PHN的疾病机制,寻找能预测老年PHN发生的血清标志物,具有重要意义。甲基转移酶样因子3(methyltransferase 3,METTL3)基因编码N6甲基腺苷(N6-methyladenosine,m6A)转移酶复合物催化亚单位,参与RNA合成、成熟和翻译等过程,与炎症、免疫系统疾病等关系密切[3]。研究表明,METTL3的表达下调能够增加脊髓神经元中甲基胞嘧啶双加氧酶1 mRNA的水平,导致炎症疼痛时超敏反应的发生[4]。半乳糖凝集素3(galectin-3,Gal-3)是半乳糖凝集素家族成员,能够结合β-半乳糖苷,参与先天免疫、细胞黏附和T细胞调节等生物学过程[5]。研究发现,坐骨神经内的施旺细胞中Gal-3的表达升高能够促进巨噬细胞浸润,导致神经病理性疼痛的发生[6]。本研究通过研究老年HZ病人在HZ急性期外周血METTL3、Gal-3的表达水平,探讨其对PHN的预测价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取我院自2019年1月至2022年1月期间我院诊治的190例老年HZ病人作为HZ组,其中男97例,女93例,年龄60～73岁,平均年龄(65.77±3.17)岁。病例纳入标准:(1)HZ的诊断符合2018年中国医师协会皮肤科医师分会制定的《带状疱疹中国专家共识》[7];(2)年龄≥60岁,急性起病,病程<7 d;(3)病人和家属对本研究知情同意并签署知情同意书。排除标准:(1)合并偏头痛等其他慢性疼痛性疾病;(2)合并获得性免疫缺陷综合征、系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病;(3)合并精神系统疾病;(4)临床资料不完整或失访病例。另选取50例健康体检的健康老年人为对照组,其中男26例,女24例,年龄60～72岁,平均年龄(65.16±3.23)岁,既往均无偏头痛、自身免疫系统疾病等。HZ组和对照组性别、年龄比较,差异无统计学意义(均P>0.05)。本研究经本院伦理委员会审核批准通过(伦理批号:M2018CK021)。

1.2 研究方法

1.2.1 METTL3、Gal-3表达检测:留取HZ组及对照组清晨空腹静脉血5 mL于EDTA抗凝管中,平均分为2份,一份常温下2000 r/min离心10 min收集上层,应用ELISA法检测Gal-3蛋白水平,步骤按照实际和说明书进行,人Gal-3 ELISA试剂盒购自上海初态生物科技公司(货号:CT5545)。微量紫外分光光度计Narodrop 2000购自美国赛默飞公司。另一份采用荧光定量PCR检测外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)中METTL3 mRNA水平。PBMC分离方法:将EDTA抗凝的外周血按照1∶1比例加入1×稀释洗涤液,轻柔混匀后加入单个核细胞分离液上方(分离液:稀释全血=1∶2),1000 r/min室温离心30 min,吸取白膜层,即PBMC层。利用Trizol法提取PBMC中总RNA。Ficoll稀释液和分离液购自美国Sigma公司(货号:CAS26873-85-8)。焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解后检测总RNA浓度和纯度,吸光度(OD)260/OD280比值介于1.8～2.1之间。将总RNA反转录为cDNA,反转录试剂盒购自北京索莱宝公司(货号:RP1100)。应用实时荧光定量PCR检测METTL3 mRNA的相对表达量。引物由上海生工公司设计合成。ABI 7500实时荧光定量PCR仪购自美国ABI公司。引物序列,METTL3正向:5’-CCAGCCTCAGCATAGCACCT-3’,反向:5’-ACCCCAAGGGGAGCCATAAC-3’;GAPDH正向:5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’,反向:5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’。反应程序:95℃ 5 min,95℃变性30 s,62 ℃退火30 s,72℃延伸30 s,变性退火延伸共35个循环。总体系20μL:SYBR Green Premix 10μL,上下游引物各1μL,cDNA 1μL,双蒸水7μL。采用2-ΔΔCt法计算METTL3 mRNA的相对表达量。

1.2.2 资料收集:收集HZ组病人的临床资料,包括病人性别、年龄、病程、发病部位(颜面部、躯干四肢部、混合型)、发病疼痛程度、带状疱疹分型(顿挫型或普通型、大疱型、出血型或坏疽型)及是否接受小剂量糖皮质激素治疗。发病疼痛程度采用VAS进行评估,分值范围为0～10分,分数越高表示疼痛程度越严重。

1.2.3 治疗和随访分组:所有HZ病人均接受足量抗病毒药物治疗,伐昔洛韦片0.3 g/次,2次/d,连用10 d。随访3个月,以门诊方式随访,当病人局部皮疹消退,疼痛持续≥3个月,同时符合美国神经病协会制定的PHN诊断标准[8],则诊断为PHN。根据HZ组病人随访3个月时是否发生PHN分为PHN组(n=44)和NPHN组(未发生PHN,n=146)。

2 结果

2.1 HZ组与对照组METTL3 mRNA、Gal-3水平比较 HZ组病人外周血PBMC中METTL3 mRNA相对表达量为(1.44±0.24),低于对照组(2.35±0.41),差异具有统计学意义(t=20.198,P<0.001)。HZ组病人血清Gal-3水平为(2.16±0.31)μg/L,高于对照组(1.02±0.27)μg/L,差异具有统计学意义(t=23.734,P<0.001)。

2.2 PHN组病人METTL3、Gal-3表达与VAS评分的相关性 Pearson相关分析显示,PHN组病人METTL3 mRNA与VAS评分呈明显负相关(r=-0.612,P<0.001),Gal-3蛋白与VAS评分呈明显正相关(r=0.604,P<0.001)。PHN组病人METTL3 mRNA与Gal-3蛋白呈显著负相关(r=-0.616,P<0.001)。

2.3 影响PHN发生的单因素分析 PHN组病人在HZ急性期的VAS评分、病程及血清Gal-3水平高于NPHN组,而PBMC中METTL3 mRNA表达水平低于NPHN组,差异具有统计学意义(均P<0.05)。见表1。

表1 PHN组和NPHN组病人临床资料的比较

2.4 多因素Logistic回归分析影响老年PHN的因素 以是否发生PHN为因变量,将表1中差异有统计学意义的指标,包括METTL3 mRNA、Gal-3蛋白、VAS评分及病程为自变量,纳入多因素Logistic回归分析,结果显示病程、Gal-3蛋白水平是影响老年PHN发生的独立风险因素,METTL3 mRNA是保护因素。见表2。

表2 多因素Logistic回归分析影响老年PHN的因素

2.5 METTL3 mRNA、Gal-3蛋白对老年PHN的预测价值 METTL3 mRNA、Gal-3蛋白两者联合预测老年PHN的AUC为0.924,高于METTL3 mRNA、Gal-3 蛋白单项检测(AUC=0.812、0.859),差异具有统计学意义(Z=4.312,3.363,均P<0.01)。见表3。

表3 METTL3 mRNA、Gal-3蛋白对老年PHN的预测价值

3 讨论

PHN是一种神经病理性疼痛,表现为刀割样、针刺样及感觉异常等。PHN的发病率随年龄的增加逐渐升高,60～65岁的老年HZ病人PHN的发病率约为20%,80岁以上老年病人的发病率达30%以上[9]。目前PHN的治疗包括药物治疗、微创介入治疗等,但由于老年人群是HZ的主要发病人群,常伴有基础疾病、免疫功能降低、临床抗病毒治疗多有受限、神经系统损伤修复能力相对较差,故老年病人更易并发PHN[10]。目前认为,PHN的发生与中枢或外周致敏、神经炎症反应及机体细胞免疫功能降低等因素有关[11]。深入研究PHN发生的机制,寻找HZ急性期的血清学标志物,有助于PHN的早期诊治。

m6A是一种RNA的甲基化修饰方式,参与细胞生长、神经信号转导等过程。研究表明,m6A修饰的异常与神经损伤后神经性疼痛症状的发生密切相关[12]。METTL3是m6A甲基转移酶的“书写者”,定位于核旁斑,参与神经系统发育过程[13]。本研究中,老年PHN病人HZ急性期外周血PBMC中METTL3 mRNA表达降低是老年HZ病人PHN发生发展的独立风险因素。分析其原因,可能与METTL3参与调控神经系统炎症反应有关。有学者发现,脊髓中METTL3的表达下调导致miR-365-3p前体稳定性降低,TNF-α、IL-6及IL-1β等促炎性细胞因子过度表达,促进神经损伤处巨噬细胞聚集,导致神经脱髓鞘和神经性疼痛的发生[13-14]。Zhang等[15]研究报道,METTL3的表达下调能够促进miR-150的表达及成熟,miR-150通过抑制脑源性神经生长因子的表达,抑制Ras-丝裂原活化蛋白激酶通路的活化,减弱脑源性神经生长因子对神经元损伤的修复能力,导致PHN的发生。本研究中,METTL3 mRNA表达与VAS评分呈负相关,提示METTL3 mRNA表达降低加重病人疼痛严重程度。有研究显示,脊髓神经元中过表达METTL3能够降低甲基胞嘧啶双加氧酶1 mRNA中m6A修饰水平及蛋白表达,减轻炎症性疼痛及痛觉过敏等PHN症状[4]。提示METTL3 mRNA是评估老年PHN发生的潜在生物标志物。

Gal-3是半乳糖凝集素家族的成员,参与调节细胞黏附、炎症免疫细胞趋化及细胞凋亡,在自身免疫性疾病、心力衰竭等疾病中发挥重要作用。本研究中,Gal-3蛋白表达升高是影响HZ病人PHN发生的独立风险因素,提示Gal-3蛋白是新的评估老年PHN发生的标志物。分析其机制可能是Gal-3促进神经细胞的炎症反应。研究发现,脑组织缺血再灌注损伤能诱导小胶质细胞中Gal-3表达,Gal-3以自分泌或旁分泌方式结合激活小胶质细胞表面Toll样受体4,促进IL-1β的分泌,导致神经炎症及神经性疼痛的发生[16]。本研究中,血清Gal-3表达与VAS评分呈正相关,表明Gal-3的表达升高加重病人疼痛程度。Takasaki等[17]发现,在脊髓背角的F4/80阳性细胞能够分泌产生Gal-3,Gal-3通过促进细胞外信号调节激酶1/2的表达和磷酸化激活,加重HZ的疼痛程度。

本研究中,PHN组METTL3 mRNA与Gal-3蛋白呈负相关,提示两者在老年PHN发生过程中可能存在相互作用的关系。笔者分析,METTL3能够通过m6A调节下游微小RNA的成熟,其表达降低导致微小RNA-124的表达缺失,Gal-3 mRNA稳定性增加,Gal-3蛋白表达增加[18]。ROC曲线分析显示,METTL3 mRNA联合Gal-3蛋白对老年PHN的发生具有较高的预测效能,敏感度和特异度分别为80.2%和90.4%。临床医师可根据老年HZ病人METTL3 mRNA、Gal-3蛋白水平,对PHN发生的风险进行评估,对于高危病人予以早期诊断和治疗,预防PHN的发生。

综上所述,老年HZ病人外周血PBMC中METTL3 mRNA表达降低,血清Gal-3蛋白表达升高,两者与VAS评分高度相关。METTL3 mRNA是影响老年PHN发生的独立保护因素,Gal-3蛋白是风险因素,两者联合检测可作为评估老年PHN发生的血清生物学指标。本研究也存在一定的不足,如样本量有限,有待今后设计多中心临床试验扩大样本量进一步研究。