羊水原位培养法联合染色体微阵列分析在产前诊断中的应用

向文秀,钱罡

(1.怀化市妇幼保健院遗传科,湖南怀化 418099;2.浙江博圣生物技术股份有限公司,杭州 310012)

染色体病是导致出生缺陷的原因之一,是由染色体数目异常或结构异常引起的一类遗传性疾病。患者主要表现为智力低下、生长发育迟缓和多发畸形等,目前尚无有效治疗手段,主要通过产前筛查和产前诊断来控制并减少患儿的出生。

孕中期对胎儿羊水细胞进行染色体核型分析是产前诊断中检测胎儿染色体异常的经典、常用且经济的方法。该技术可以明确诊断出胎儿染色体数目异常和大于5 Mb大片段的结构异常[1]。各指南推荐羊水原位培养法为羊水染色体核型分析的首选方法,有助于提高真假嵌合的判断[2],但其检测分辨率有限,对小于5 Mb的微缺失、微重复等小片段结构异常的诊断能力不足。染色体微阵列分析(chromosome microarray analysis,CMA)技术是在全基因组水平上使用高密度DNA探针对目标DNA进行杂交,通过扫描荧光信号分析其拷贝数变异(copy number variant,CNV),可检测出1 kb以上的CNV,对微缺失和微重复具有明显检测优势。联合应用核型分析和CMA技术,既可检测显微水平的结构变异,又可发现亚显微水平的CNV,有助于提高产前诊断的检出效率。

本研究回顾分析采用羊水原位培养法联合CMA检查的3 133例样本结果,评估两种方法在不同产前诊断指征下的检出效率,为临床诊断应用提供参考依据。

1 对象与方法

1.1研究对象 收集2018年10月至2023年2月在怀化市妇幼保健院接受羊水原位培养法联合CMA产前诊断的3 133例孕妇资料,孕妇年龄17～46岁,孕周16～39周。所有孕妇均签署产前诊断知情同意书后在超声引导下行羊膜腔穿刺术采集羊水样本。入选指征包括:孕妇年龄≥35岁;超声筛查异常(如鼻骨缺失、双侧脉络膜囊肿等软指标异常和胎儿结构异常);血清筛查高风险(21-三体综合征MOM值>1/270,18-三体综合征MOM值>1/274);无创DNA筛查高风险(21-三体综合征高风险、18-三体综合征高风险、13-三体综合征高风险);不良妊娠史(胚胎停育、自然流产等);夫妻一方染色体异常(患染色体病或为携带者)。本研究获本院伦理委员会批准(批准文号:202308)。

1.2方法

1.2.1羊水原位培养法 (1)采样及接种:在超声引导下采集16～20 mL羊水,注入2个无菌离心管,378×g水平离心10 min。吸去部分上清液,分别加入1 mL羊水培养基(美国Thermo Fisher Scientific公司),充分混匀后接种至原位培养盒的载玻片上,每例接种2个原位培养盒,在37 ℃、5% CO2条件下培养48 h,添加3 mL新鲜羊水培养基继续培养。(2)换液:培养7～8天后,在倒置显微镜下观察细胞生长情况,贴壁细胞克隆5～10个,10倍镜下面积占据一半以上视野且透亮细胞较多时,用3 mL新鲜羊水培养基替换后次日收获细胞。(3)收获:加入秋水仙素50 μL(终浓度为5 μg/mL),置于37 ℃、5% CO2培养箱中温育30 min,吸去培养盒中液体。加入5 mL预温的低渗液(0.75 mol/L氯化钾),37 ℃培养箱中低渗30 min后加入1 mL 5%冰乙酸,室温预固定15 min。吸去液体,加入5 mL固定液(甲醇∶冰乙酸=3∶1)漂洗后吸去固定液,加入5 mL固定液固定15 min。吸去固定液,再加入5 mL固定液。将玻片转移至25 ℃、50%相对湿度条件的分散仪中进行分散。80 ℃烤片3 h后行G显带染色。

1.2.2核型分析 每例计数2张原位载玻片上20个细胞克隆的20个细胞,每克隆仅计数1个细胞,分析5个细胞核型,分辨率不低于400条带。如遇异常,则加大计数或分析细胞数。核型结果按国际人类细胞遗传命名系统(International System for Human Cytogenetic Nomenclature,ISCN)描述。若发现羊水染色体嵌合体,则根据中国卫生行业标准WS322.2—2010,对不同类型嵌合体分别进行高强度额外工作(额外检查24个克隆细胞)、中强度额外工作(额外检查12个克隆细胞)以及无需额外工作。

1.2.3染色体微阵列分析 收集羊水于无菌离心管,采用全基因组DNA提取试剂盒(北京天根公司)提取DNA。经质检后,DNA进行酶切消化形成粘性末端,在酶切产物两端加上特异性识别该末端的接头,使用特异性引物通过PCR扩增获得高丰度基因组DNA。采用磁珠法纯化PCR产物,测定浓度达标后,使用片段化酶将DNA片段化,脱氧核苷酸末端转移酶标记小片段末端。标记产物加入Cytoscan 750K Array微阵列芯片(美国Affymetrix公司)杂交16～18 h,洗涤去除未杂交DNA。放入芯片扫描仪中扫描,使用Chas软件读取数据,将芯片结果比对实验室本地数据库及公共数据库,对染色体CNV进行分类评估。

1.2.4观察指标 因单一产前诊断指征行产前诊断者归为单指征组,同时具有2种产前诊断指征者归为双指征组(本研究未见≥3种指征者)。比较分析不同产前诊断指征组孕妇羊水样本的核型及CMA结果。记录联合检查的异常情况,其中任一单项检查结果提示异常则统计为联合检查异常;核型分析检出异常但CMA未检出异常统计为核型分析检出异常;核型分析未检出异常但CMA检出异常统计为CMA检出异常。

2 结果

2.1不同指征下的异常检出率 共3 133例采用羊水原位培养法联合CMA进行产前诊断(表1),其中,1 993例(63.61%)孕妇因单项指征进行产前诊断,1 140例(36.39%)孕妇因两项指征进行产前诊断。血清学筛查高风险是主要指征,单纯因血清学筛查高风险进行产前诊断者占34.98%(1 096/3 133),血清学筛查高风险合并其他指征者占30.89%(968/3 133);其次为年龄高风险,单纯年龄高风险及合并其他指征者分别占7.98%(250/3 133)和35.27%(1 105/3 133);再其次为超声异常,单纯超声异常及合并其他指征者分别占14.59%(457/3 133)和3.38%(106/3 133)。

表1 不同产前诊断指征羊水原位培养法联合CMA检出结果[n(%)]

单指征组联合检查异常483例,异常检出率24.23%,其中羊水原位培养法分析异常184例,异常检出率9.23%;CMA异常432例样本,异常检出率21.68%。双指征组联合检查共检出313例,异常检出率27.46%,其中羊水原位培养法异常116例,异常检出率10.18%;CMA异常274例,异常检出率24.04%。双指征组异常检出率均高于单指征组(羊水原位培养法增加0.95%,CMA法增加2.36%),CMA异常检出率均高于核型分析。

2.2羊水原位培养法和CMA对染色体异常检出的一致性 3 133例样本中,羊水原位培养法和CMA结果均正常的样本2 726例(含染色体多态),异常检出结果一致的176例,其中非整倍体(不含嵌合体)共145例,包含21-三体综合征85例、18-三体综合征23例、13-三体综合征2例、性染色体非整倍体35例(见表2),其余31例为染色体结构异常。

表2 羊水原位培养法和CMA检出的非整倍体异常分类

2.3羊水原位培养法和CMA对染色体异常检出的差异性 在羊水原位培养法检测结果正常的病例中,CMA检出169例提示致病或可能致病CNV,其中主要的异常类型为≤10 Mb的微缺失/微重复共117例,占69%,其次为杂合性缺失(LOH)共29例,占17%,然后是15例杂合性不存在(AOH)/纯合区域(ROH)占9%,8例经家系验证为单亲二倍体(UPD),占5%。

在CMA检测正常的病例中,羊水原位培养法检出11例染色体结构异常。其中包含5例罗氏易位,3例平衡易位,2例插入以及1例环状染色体,见表3。

表3 羊水原位培养法检测异常但CMA检测正常结果

在嵌合体检出方面,羊水原位培养法和CMA共发现23例嵌合体,其中羊水原位培养法检测出20例嵌合体,CMA检测出11例嵌合体。有7例嵌合体羊水原位培养法与CMA结果一致;有12例羊水原位培养法检测为嵌合体,CMA检测为微缺失/微重复或正常;另有4例CMA检测为嵌合体,羊水原位培养法检测为衍生染色体或正常,见表4。

表4 羊水原位培养法和CMA在嵌合体方面的检出情况

3 讨论

本研究中羊水原位培养法异常检出率为9.58%,与国内报道一致[3]。引入CMA技术后,联合检测异常检出率较单独使用羊水原位培养法提高15.83%(达25.41%),显著提升了对染色体病的诊断效率及准确性,与潘云等[3]研究结论一致。将不同产前诊断指征分组后分析发现,双指征组羊水原位培养法及CMA异常检出率分别为10.18%和24.04%,均高于单指征组(分别为9.23%和21.68%),说明多项产前诊断指征可有助于提高发现高危孕妇的概率。分析羊水原位培养法与CMA异常检出率差异发现,两者对于染色体非整倍体异常及大片段结构异常均有极高的检出率。但CMA也在羊水原位培养法染色体核型分析正常病例中检出微缺失/微重复、LOH和UPD(核型无法检测<5 Mb异常),而羊水原位培养法则检出平衡性重排(易位、环状、插入)异常(CMA技术无法检出)[4]。因此,两者结合后互补长短,联合的异常检出率(25.41%)高于单独使用任一技术。

本研究联合检测出嵌合体发生率为0.73%(23/3 133),主要为21-三体嵌合,其次为性染色体嵌合。其中,羊水原位培养法检出20例嵌合体(0.64%),与国内报道[5]的真性嵌合发生率接近;但有12例CMA未提示嵌合,可能因PCR扩增改变原嵌合比例,导致低于10%的低比例嵌合体出现漏检现象。CMA检测出11例嵌合体(0.35%),其中4例羊水原位培养法未发现,主要由于细胞培养过程中部分细胞丢失或者优势生长导致。本研究中羊水原位培养法嵌合体检出率(0.64%)高于CMA(0.35%),与付爱红等[6]研究结果一致。

综上所述,羊水原位培养法联合CMA技术对非整倍体异常及嵌合体检出率更高。前者在检测染色体平衡重排上优势明显,而后者高分辨率可有效检出微小片段异常,因此羊水原位培养法联合CMA技术可互补长短,极大提升了临床上诊断染色体病的准确性,在产前诊断中具有重要应用价值。