谷胱甘肽通过Nrf2/ARE通路改善四氯化碳诱导大鼠肝损伤和肝纤维化*

梁玉梅 陈维宪 黄群锋

(1.南方医科大学珠江医院药学部,广东 广州 510260; 2.广州市番禺区妇幼保健院药剂科,广东 广州 511400;3.广州医科大学附属第五医院肿瘤科,广东 广州 510700)

肝纤维化是肝脏在受到外界刺激后发生的自我修复和伤口愈合,导致肝脏中细胞外基质的过度产生和沉积[1-2]。肝纤维化病程迁延而可逆,若无积极有效干预措施可进展为肝硬化,进而引发肝衰竭、肝性脑病、胃食管静脉曲张破裂出血等一系列严重并发症,给患者造成极大痛苦和死亡风险,同时也给社会带来了巨大经济负担。因此,肝纤维化的早期诊断和有效干预尤为重要,其确诊有赖于肝纤维化分子基础的研究。相关的临床和实验研究表明,肝损伤消除后可能会出现纤维化消退[3-4]。肝星状细胞(Hepatic stellate cell,HSCs)的活化是肝纤维化发病机制中的关键环节,激活过程的特征是表型从静止的富含维生素A的表型转变为肌成纤维细胞的纤维化表型[5]。

许多具有抗氧化作用的人工和天然制剂已被建议用于治疗和预防过度氧化应激引起的肝病[6]。因此,补充抗氧化剂对人体健康有益。谷胱甘肽(Glutathione,GSH)是一种内源性三肽,肝脏是其含量最高的组织之一。补充内源性谷胱甘肽的有效方法是使用S-酰基前药,如S-乙酰基-谷胱甘肽(S-acetyl-glutathione,SAG),其能够穿过细胞膜并增加细胞内SH基团[7]。与直接进入细胞的GSH不同,SAG在血浆中更稳定,一旦进入细胞质,就会被细胞质硫酯酶转化为GSH。特别是,硫原子的乙酰化避免了谷胱甘肽的分解,并简化了其通过肠壁的吸收[8]。四氯化碳(Carbon tetrachloride,CCl4)诱导的肝损伤被广泛用于人类肝脏疾病的实验模型和鉴定潜在的肝保护剂。目前已经证实,靶向Nrf2-ARE信号通路可以保护肝脏免受CCl4诱导的损伤[9]。据报道,海地瓜中的胶原蛋白肽通过Keap1/Nrf2-ARE、PI3K/AKT和MAPKs途径预防CCl4诱导的肝损伤[10]。红松松仁多糖PNP40c-1通过NRF2/ARE/MKP1/JNK信号通路对CCl4诱导的小鼠肝损伤发挥肝脏保护作用[11]。基于这些研究,我们猜想谷胱甘肽通过Nrf2/ARE通路改善CCl4诱导大鼠肝损伤和肝纤维化。本研究建立了CCl4诱导的大鼠肝损伤和纤维化的假设来验证谷胱甘肽对肝损伤、胶原蛋白产生、HSC活化和体内氧化应激的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 CCl4、GSH购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司(中国),qRT-PCR引物购自北京擎科生物科技股份有限公司(中国),ALT、AST、ALP、羟脯氨酸测定试剂盒、LPO、MDA、GSH检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所,IL-6、TNF-a和IL-1β ELISA测定试剂盒购自美国Millipore公司,一抗anti-α-SMA、anti-α1(I)procollagen、anti-fibronectin、anti-TGF-βR1、anti-PDGF-βR、anti-EGFR、anti-Nrf2、anti-ARE和anti-β-actin购自Abcam公司,细胞色素P450 2E1(CYP2E1)活性检测试剂盒购自上海臻科生物科技有限公司。

1.2 动物模型构建 雄性SD大鼠(体重180～220 g)购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。参考前述研究进行[12],用CCl4(0.1 mL/100 g体重)和橄榄油[1∶1(w/v)]的混合物诱导大鼠肝损伤。将32只大鼠按照配对比较法随机分为4组,每组8只。第1组为对照组,大鼠腹腔注射橄榄油,未注射CCl4或GSH。第2组为CCl4组,大鼠腹腔注射CCl4,未经GSH处理。第3组为低剂量治疗组,大鼠静脉注射CCl4,并灌胃50 mg/kg GSH。第4组为高剂量治疗组,大鼠静脉注射CCl4,并灌胃100 mg/kg GSH。第2至4组大鼠每隔一天腹腔注射CCl4,持续8周。将GSH溶于橄榄油中,在第5至8周每天灌胃一次。实验结束时,大鼠经腹腔注射戊巴比妥(50 mg/kg)麻醉后处死。采集血液,分离肝脏并称重。实验期间,所有大鼠生长良好,未出现死亡。本研究经我院伦理委员会审核批准(批准号：AEWC-2201061)。

1.3 肝组织病理学分析 参考前所述进行苏木精-伊红(HE)染色和天狼星红染色[13],分析肝组织切片的病理变化。

1.4 肝细胞色素P450 2E1(CYP2E1)活性的测定 将0.1 mL样品添加到含有70 mM Tris-HCl(pH 7.4)、10.0 mM氨基脲、14 mM MgCl2、215 mM KCl和4 mM NADPH的混合物中,最终体积为1.0 mL。在37 ℃下孵育混合物30 min,之后通过添加1.5 mL 12.5%三氯乙酸来终止反应。在2000 rpm离心1.5 min后,将2 mL上清液与1.0 mL含有6 M乙酸铵、60 mM乙酰丙酮和0.15 M乙酸的NASH试剂混合。然后将试管在70 ℃下孵育20 min,并在415 nm处测量形成的六氯环己烷。CYP2E1活性以每分钟每毫克蛋白质的纳摩尔数表示。

1.5 ELISA检测相关指标水平 收集大鼠的血清样本,使用ELISA试剂盒检测丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)的水平;用ELISA试剂盒检测IL-6、TNF-a和IL-1β水平。

1.6 肝组织羟脯氨酸的测定 将从每只大鼠肝脏随机切下的三小块肝组织在110 ℃的6N HCl中水解24 h,随后用NaOH中和。在水解产物的等分试样中加入柠檬酸盐缓冲氯胺T中的异丙醇,然后加入Ehrlich试剂。在60 ℃的避光条件下孵育25 min。离心后,使用96孔板光谱仪在558 nm处读取每个样品的上清液的吸光度。

1.7 qRT-PCR检测基因表达水平 通过Trizol法进行总RNA提取,PrimeScript RT Reagent Kit(Takara,Japan)用于cDNA合成,随后使用SYBR Green PCR Kit(Takara,Japan)进行qRT-PCR分析检测基因表达,β-actin分别作为检测目的基因表达量的内参,引物序列见表1。使用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.8 Western blot检测蛋白表达水平 肝脏样品在含有蛋白酶抑制剂的放射免疫沉淀分析(RIPA)缓冲液中匀浆。使用BCA检测试剂盒(Pierce,USA)测定蛋白水平,蛋白质通过十二烷基硫酸钠(SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离,转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Millipore,USA)上,用含0.1%吐温20的Tris缓冲盐水的5%脱脂奶粉封闭。通过相应的一级抗体和随后的辣根过氧化物酶偶联的二级抗体检测目标蛋白。使用化学发光试剂(Millipore,USA)对蛋白质条带进行可视化。

1.9 检测脂质过氧化(LPO)、丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)的水平 使用LPO、MDA和GSH检测试剂盒分别测定肝脏组织中LPO、MDA和GSH水平。

2 结果

2.1 谷胱甘肽保护大鼠肝脏免受CCl4诱导的损伤 HE染色结果显示,CCl4治疗诱导了严重的肝损伤,表现为弥漫性小叶中心坏死伴全小叶炎症,而谷胱甘肽预处理减轻了CCl4诱导的坏死和炎症细胞浸润,见图1A;在CCl4治疗的大鼠血清中ALT、AST和ALP水平显著升高,谷胱甘肽剂量依赖性地降低了血清ALT、AST和ALP水平,并且高剂量的谷胱甘肽在降低血清ALT、ALT和ALP水平方面更为显著(P<0.05),见图1B;CCl4处理后,大鼠肝脏CYP2E1活性被激活,而谷胱甘肽显著降低CYP2E1的活性(P<0.05),见图1C;CCl4导致大鼠血清中IL-6、TNF-a和IL-1β的显著增加,而谷胱甘肽治疗显著逆转了这一结果(P<0.05),见图1D。综上提示,谷胱甘肽可以改善CCl4注射引起的肝损伤。

图1 谷胱甘肽保护大鼠肝脏免受CCl4诱导的损伤

2.2 谷胱甘肽可以降低CCl4诱导的大鼠肝脏中胶原蛋白表达 天狼星红染色检测大鼠肝脏中胶原蛋白的表达结果显示,在CCl4诱导的大鼠肝脏中胶原蛋白严重沉积,并伴有结节形成,谷胱甘肽可以逆转这一影响(图2A);α1(I)型前胶原(α1(I)procollagen)的免疫荧光染色显示类似的结果(图2B),表明谷胱甘肽减少了纤维化肝脏中的α1(I)型前胶原表达。肝羟脯氨酸的测定结果显示,谷胱甘肽以剂量依赖显著降低了纤维化肝脏中羟脯氨酸的含量(图2C),表明纤维化肝脏中胶原蛋白的积累减少(P<0.05)。综上提示,谷胱甘肽可以通过抑制大鼠胶原的表达来减弱CCl4诱导的肝纤维化。

图2 谷胱甘肽可以降低CCl4诱导的大鼠肝脏中胶原蛋白表达

2.3 谷胱甘肽抑制CCl4引起的大鼠纤维化肝脏中HSC的活化 qRT-PCR和Western blot结果显示,α-SMA、α1(I) procollagen、fibronectin、TGF-βR1、PDGF-βR和EGFR在mRNA和蛋白水平上的表达显著增加,表明纤维化肝脏中HSC过度活化。然而,谷胱甘肽治疗以剂量依赖性地降低了这些标记物的mRNA和蛋白表达(P<0.05),见图3。综上提示,谷胱甘肽抑制了CCl4引起的大鼠纤维化肝脏中HSC的激活。

图3 谷胱甘肽抑制CCl4引起的大鼠纤维化肝脏中HSC的活化

2.4 谷胱甘肽减轻CCl4引起的大鼠纤维化肝脏氧化应激 为了评估谷胱甘肽对体内氧化应激的影响,我们测定了肝组织匀浆中LPO和MDA的水平。CCl4的处理显著增加了大鼠肝脏LPO和MDA的水平,但谷胱甘肽的治疗以剂量依赖的方式降低了LPO和MDA的水平(P<0.05),见图4A、B;我们的结果发现CCl4处理的大鼠肝脏GSH水平显着降低,但是通过谷胱甘肽处理以剂量依赖的方式得到改善(P<0.05),见图4C。提示谷胱甘肽减轻了CCl4给药引起的大鼠纤维化肝脏的氧化应激。

图4 谷胱甘肽减轻CCl4引起的大鼠纤维化肝脏氧化应激

2.5 谷胱甘肽促进Nrf2/ARE通路的活性 为了研究Nrf2/ARE信号通路是否参与谷胱甘肽对CCl4诱导的肝损伤的保护作用,我们检测了Nrf2和ARE在CCl4诱导大鼠肝组织中的表达。结果表明,CCl4处理显著降低了Nrf2和ARE的表达,而谷胱甘肽显著提高Nrf2和ARE的表达(图5A),以上结果提示Nrf2/ARE信号通路可能参与了谷胱甘肽对CCl4诱导的肝损伤的保护作用。为了进一步证实谷胱甘肽对CCl4诱导大鼠肝组织Nrf2/ARE信号通路的影响,我们检测了Nrf2下游抗氧化基因的表达。结果显示,CCl4处理后降低的GST、GCLc、NQO1和HO-的表达,而在谷胱甘肽处理后明显逆转这一结果(P<0.05),见图5B～E,进一步验证了谷胱甘肽可以改善CCl4诱导的大鼠纤维化肝脏氧化应激。

图5 谷胱甘肽促进Nrf2/ARE通路的活性

3 讨论

CCl4诱导肝损伤模型已被广泛应用于肝脏病理研究,其形态学和生化特征与人类肝脏疾病细胞病变相似[14]。CCl4处理后大鼠肝脏细胞色素P450被激活,然后产生三氯甲基自由基,与细胞大分子共价偶联,从而影响细胞功能;产生的CCl3攻击肝细胞膜上的磷脂分子,引起脂质过氧化反应,并破坏肝细胞膜结构和功能的完整性。与此同时,肝组织中SOD、MDA和其他相关脂质过氧化指数的水平发生改变,最终导致肝功能受损[15]。刺激肝细胞向血液中释放各种酶,包括ALT、AST和ALP,这是肝细胞损伤的标志物[16]。除了上述反应外,CCl4还会引起体内炎症,导致血液中的炎性细胞因子(IL-6和TNF-α)和肝组织中的炎症细胞因子(COX-2和PGE2)发生变化[17]。在代谢组学方面,CCl4被人体吸收后,细胞色素P450水平升高,导致一系列脂质过氧化反应,造成三羧酸循环紊乱,其他相关途径也受到影响[18]。本文研究了谷胱甘肽对CCl4诱导的肝损伤大鼠肝组织病理变化和肝脏指标的影响。结果表明,谷胱甘肽可以降低大鼠血液中的ALT、AST、ALP、TNF-α、IL-6和IL-1β水平。

HSC活化是肝纤维化过程中的关键步骤,因为活化的HSC是胶原和其他细胞外基质成分的主要来源。HSC激活的过程伴随着一系列标志蛋白的上调表达[19]。活化HSC的减少可能导致胶原的产生和沉积减少;另一方面,HSC的激活是由各种细胞因子和趋化因子触发的,包括TGF-β、PDGF和EGF,从枯否氏细胞、窦内皮细胞和活化的HSC自身释放[20]。HSC的激活过程与相应受体的上调有关,包括TGF-βR1、PDGF-βR和EGFR。本研究结果显示,谷胱甘肽抑制了CCl4大鼠模型中促纤维化受体的表达,表明谷胱甘肽可以阻断TGF-β、PDGF和EGF通路,从而抑制体内HSC的激活。此外,许多研究表明,HSC中的胶原表达受到这些促纤维化级联的转录调节[21-23]。因此,可以推测谷胱甘肽减少胶原生成可能是这些级联的中断所致,有助于抗纤维化的功效。

越来越多的研究表明,氧化应激与不同病因的肝纤维化有关。CCl4在肝脏中的代谢导致脂质过氧化和ROS的产生,ROS可以引发氧化应激过程[24]。在本研究中,我们证实了CCl4损伤肝脏的氧化应激增强,表现为LPO和MDA水平显著升高。然而,谷胱甘肽显著消除了大鼠肝脏中LPO和MDA水平的增加,表明氧化应激减弱。此外,氧化应激可能代表HSC激活的直接或间接促纤维化刺激[25-26]。氧化应激的现象伴随或先于HSC活化和胶原沉积。有证据表明,培养的人或大鼠HSC暴露于促氧化系统或经历氧化应激的肝细胞释放的产物的培养基后,I型前胶原基因的表达和合成增加[27]。此外,谷胱甘肽是最丰富的非酶抗氧化剂,在氧化还原系统中发挥着重要作用。本研究发现谷胱甘肽有效地逆转了纤维化肝脏中GSH含量的减少,表明GSH的恢复可能是谷胱甘肽抗纤维化作用的重要机制之一。

先前研究报道Nrf2/ARE通路参与CCl4诱导的肝损伤[28]。据报道,鲑鱼精子DNA通过Nrf2/ARE和线粒体凋亡途径预防CCl4诱导的小鼠急性肝损伤[9]。Han等[29]发现黄连素通过调节Nrf2-Keap1-ARE和p53信号通路改善CCl4诱导的大鼠肝损伤。另一项研究报道熊果酸通过Nrf2/ARE通路改善CCl4诱导的大鼠肝纤维化[30-32]。本研究的结果显示CCl4诱导的大鼠肝脏中Nrf2和ARE的表达受到抑制,而谷胱甘肽可以恢复Nrf2/ARE通路活性,揭示谷胱甘肽可能通过激活Nrf2/ARE通路改善CCl4诱导的大鼠肝损伤和肝纤维化。

4 结论

谷胱甘肽在体内保护大鼠肝脏免受CCl4引起的损伤和纤维化,这些作用可能与抑制HSC活化和减轻肝脏氧化应激有关;此外,其还可能通过激活Nrf2/ARE通路改善CCl4诱导的大鼠肝损伤和肝纤维化。