日本沼虾表皮Serpin基因克隆及免疫功能的初步研究

宁黔冀 彭彦新 岳凯迪 李亦君

摘 要：丝氨酸蛋白酶级联反应介导的黑化是甲壳动物重要的免疫反应，丝氨酸蛋白酶抑制剂（serine proteinase inhibitor，Serpin）是黑化反应的重要调节因子，而甲壳动物表皮Serpin的有关研究较少.为了探索表皮Serpin在日本沼虾（Macrobrachium nipponense）免疫反应中的功能，基于前期转录组数据，利用PCR、RACE和生物信息学从日本沼虾表皮克隆并鉴定了1个新的Serpin基因，命名为MnSerpin，利用RT-qPCR和RNAi等方法，研究了该基因时空表达模式、嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）攻毒后表皮MnSerpin的转录水平以及日本沼虾死亡率的变化.结果显示，MnSerpin cDNA全长2 181 bp，编码419个氨基酸，具有Serpin结构域.MnSerpin在腹背部表皮、鳃、血细胞、胃、心、肝胰腺等多种组织均有表达；表皮MnSerpin的表达与蜕皮周期有关，与蜕皮间期（C期）相比，在蜕皮后早期（A期）最高，增加6.06倍（P＜0.01）.嗜水气单胞菌攻毒后，表皮MnSerpin的相对表达量在6 h达到了峰值，比对照组增加3.77倍（P＜0.01）.在腹背部第二节的关节膜内注射3 μg dsRNA溶液，每12 h注射1次，共注射3次，最后一次注射后12 h，干扰效率最高，表皮MnSerpin的相对表达量同比下降58%（P＜0.01）.在干扰效率最高的时间点攻毒，120 h内，干扰组虾的累计死亡率比未干扰组增加16%（P＜0.01）.结果表明，日本沼虾表皮MnSerpin是重要的免疫因子，MnSerpin的表达存在组织以及蜕皮周期不同阶段的差异，该基因表达下调能显著增加嗜水气单胞菌感染虾的死亡率.

关键词：日本沼虾（Macrobrachium nipponense）；表皮；MnSerpin；RNAi

中图分类号：S97.4文献标志码：A文章编号：1000-2367（2024）02-0123-07

无脊椎动物主要依靠天然免疫系统防御病原体入侵，其中包括体液免疫^［1］.黑化是重要体液免疫反应之一，参与伤口愈合和病原体隔离等^［2］.黑化需要丝氨酸蛋白酶（Serine protease，SP）级联反应启动酚氧化酶原（prophenoloxidase，proPO）激活，产生活性酚氧化酶（phenoloxidase，PO），PO催化单酚为醌，醌聚合形成的黑色素消灭病原体，但过量的黑色素和中间活性产物（醌类、超氧化物和PO等）将损伤细胞和组织^［3-4］.丝氨酸蛋白酶抑制剂（serine proteinase inhibitor，Serpin）是黑化反应的重要调节因子，维持生物体动态平衡^［5］.通常，作为自杀抑制剂，Serpin反应中心环（reactive center loop，RCL）的裂解键（P1-P1′）被靶蛋白识别和切割，导致不可逆的构象变化，进而与靶蛋白形成共价复合物；P1氨基酸残基决定了Serpin的特异性^［6-7］.对凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）^［8］、烟草天蛾（Manduca sexta）^［9］和家蚕（Bombyx mori）^［5］等的研究顯示，Serpin负调控SP，导致下游的proPO不能激活，抑制黑化.

目前，已经在斑节对虾（Penaeus monodon）^［10］、中国明对虾（Fenneropenaeus chinensis）^［11］、中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）^［12］、三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）^［13］的血细胞和日本囊对虾（Marsupenaeus japonicus）^［14］、红帝王蟹（Paralithodes camtschaticus）^［15］的肝胰腺等组织克隆并鉴定了Serpin，发现病原菌攻毒后Serpin基因表达增加.研究发现，甲壳动物的表皮组织不仅起到物理屏障的作用，而且具有一些免疫功能^［16］，但源于表皮组织的Serpin基因还未见报道.

日本沼虾（Macrobrachium nipponense）又名青虾、河虾，是我国重要的淡水养殖品系^［17］.嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）是一种条件致病菌，导致日本沼虾极高的死亡率^［18］.为了探索表皮Serpin在日本沼虾免疫反应中的作用，本研究首次从表皮克隆了1个Serpin基因，命名为MnSerpin，对其进行生物信息学分析；利用RT-qPCR和RNAi等方法，研究了MnSerpin的时空表达模式、嗜水气单胞菌攻毒以及MnSerpin敲降后表皮MnSerpin的转录水平和日本沼虾死亡率的变化，旨在为阐明表皮组织在甲壳动物免疫系统中的作用积累资料.

1 材料与方法

1.1 实验材料

日本沼虾购自河南省原阳黄饲渔场，选取健康虾体长（3.5±0.5） cm置于实验室玻璃水族箱内，水温设置为（27±1） ℃，早晚投喂1次.1周后，用于实验.选取3尾虾，解剖鳃、胃、肌肉、心、肝胰腺、血细胞等组织，分别选取蜕皮间期（C）、蜕皮前早期（D₀）、蜕皮前后期（D₄）、蜕皮后早期（A）和蜕皮后晚期（B）的3尾虾，取腹背部表皮组织，液氮速冻，-80 ℃保存备用.参照KIRIRAT等^［19］方法，鉴定虾的蜕皮周期.除了在蜕皮周期的表达分析外，选取C期虾作为实验材料.嗜水气单胞菌由新乡医学院实验室提供.

1.2 总RNA提取以及cDNA合成

按照Mini BEST Universal RNA Extraction Kit（TaKaRa）说明书提取各组织的总RNA，用超微量紫外分光光度计Nano Drop ONE（赛默飞）检测纯度和浓度，质量分数1%琼脂糖凝胶电泳检测.利用PrimeScript^TMOne Step RT-PCR Kit（TaKaRa）合成cDNA第一链，-20 ℃保存.

1.3 MnSerpin cDNA的全长克隆

基于本课题组日本沼虾C期头胸甲外骨骼转录组数据库中获得MnSerpin的核心序列，使用Prime primer 5.0软件设计引物MnSerpin-F和MnSerpin-R（附录表S1），扩增核心序列.根据验证的核心序列设计MnSerpin的3′和5′末端的嵌套引物（附录表S1），利用RACE的方法分别扩增3′和5′末端cDNA序列.PCR产物经电泳后，按照HiPure Gel Pure DNA Mini Kit（Magen）的方法回收纯化，连接pMD19-T载体，转化DH5α感受态细胞，筛选阳性单克隆菌株送生工生物工程（上海）股份有限公司测序.根据测序结果，使用DNAMAN软件拼接获得MnSerpin的全长cDNA序列.

1.4 生物信息学分析

利用NCBI ORF finder软件（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）分析开放阅读框；BLAST软件（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）分析氨基酸序列同源性；使用Consvered Domain Search软件（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）预测保守结构域；使用SignalP 5.0软件（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？SignalP-5.0）预测信号肽；使用ExPASy软件（https：//web.expasy.org/compute_pi/）预测蛋白质的理论等电点与相对分子量；通过Clustal W程序进行多序列比对并利用MEGA 5.1软件的邻接法构建系统发育树.

1.5 MnSerpin时空表达

以β-actin作为内参基因，利用RT-PCR（Reverse Transcription PCR）的方法检测MnSerpin的组织分布，50 μL反应体系：2×Es Taq Master Mix 25.0 μL，各组织cDNA模板1.0 μL，上下游引物各2.0 μL，灭菌ddH₂O 20.0 μL；采用降落PCR进行扩增，反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，58 ℃→48 ℃，退火30 s，72 ℃延伸150 s，共32个循环；72 ℃终延伸7 min，电泳检测不同组织对应的条带亮度.

利用RT-qPCR（quantitative real-time PCR）的方法检测MnSerpin在蜕皮周期的表达（SYBR Premix Ex Taq^TM试剂盒，TaKaRa）.20 μL反应体系：AceQ qPCR SYBR Green Master Mix 10.0 μL、蜕皮周期各阶段表皮cDNA模板2.0 μL、上下游引物各0.8 μL、滅菌ddH₂O 6.4 μL.扩增条件：95 ℃变性5 min；95 ℃变性10 s，60 ℃复性30 s，共40个循环；95 ℃变性15 s，60 ℃复性60 s，97 ℃变性1 s（融解曲线程序）.每个样品来源于3尾虾，重复3次，采用2^-△△Ct的方法计算基因的相对表达量^［8］.在SPSS19.0中进行统计分析，结果显示为平均值±标准差（n=3），单因素方差分析（ANOVA）和Duncan法进行显著性检验（P＜0.05代表差异显著，P＜0.01代表差异极显著）.

1.6 嗜水气单胞菌攻毒对表皮MnSerpin的表达影响

随机挑选虾100尾，平均分为攻毒组和对照组，分别在腹背部第二节的关节膜内注射2 μL嗜水气单胞菌菌悬液（2.5×10⁸CFU·mL^-1）或PBS，每个组设置3个重复.在注射后0、3、6、12、24、48和72 h，利用RT-qPCR分别测定表皮MnSerpin转录水平.

1.7 dsRNA对MnSerpin的干扰效率

参照ZHUANG等^［4］方法，根据Mnserpin的cDNA序列，设计含有T7启动子及保护碱基的MnSerpin的dsRNA特异性引物（附录表S1），通过RT-PCR扩增Mnserpin片段，制备合成dsRNA的质粒模板后，利用in vitro Transcription T7 Kit（TaKaRa）合成dsRNA，经纯化用于RNAi Mnserpin的表达.随机挑选虾100尾，平均分为干扰组和对照组，分别于腹背部第二节的关节膜内注射3 μg dsRNA溶液或等体积的PBS.每个组设置3个重复.每12 h注射1次，共注射3次，以加强敲除效率.在最后一次注射后0、3、6、12、24、48、72 h取表皮，利用RT-qPCR分别测定MnSerpin转录水平.

1.8 MnSerpin干扰后嗜水气单胞菌攻毒对日本沼虾死亡率的影响

随机挑选虾150尾，平均分为对照组、攻毒+未干扰组和攻毒+干扰组.攻毒+干扰组在第3次注射dsRNA溶液后12 h，注射2 μL嗜水气单胞菌菌悬液（2.5×10⁸CFU·mL^-1）；对照组、攻毒+未干扰组在第3次注射等体积PBS后12 h，分别注射2 μLPBS或嗜水气单胞菌菌悬液（2.5×10⁸CFU·mL^-1）.每组设置3个重复，在最后一次注射后0、6、12、24、48、72、96、120 h分别计算各组日本沼虾的累计死亡率.

2 结果

2.1 MnSerpin的克隆和生物信息学分析

MnSerpin的cDNA全长2 181 bp（GenBank登录号：OP626166），包括102 bp的5′UTR，819 bp的3′UTR和1 260 bp的ORF，共编码419个氨基酸.理论上蛋白质的分子量和等电点分别为45.99 kDa和5.29.该蛋白含有一个21个氨基酸残基组成的信号肽和保守的Serpin结构域，其中含有P1为Y的RCL（附录图S1和S2）.

经BLASTP比对，MnSerpin的氨基酸序列和其他甲壳动物Serpin的同源性在43.22%～50.24%，如斑节对虾（P. monodon，XP_037790831.1）为50.24%，凡纳滨对虾（P. vannamei，ROT82825.1）为49.76%（附录图S2）.基于氨基酸序列构建系统进化树，发现日本沼虾与中国对虾（Penaeus chinensis，ABC33916.1）Serpin聚为一小支，属于甲壳动物的一大支（图1）.

2.2 MnSerpin的时空表达分析

MnSerpin在腹背部表皮、鳃、胃、心、肝胰腺、血细胞等多种组织均有表达，但肌肉组织不表达（图2）.以C期为对照，表皮MnSerpin在D₀期、D₄期、A期和B期的表达量极显著增加（P＜0.01），其中在A期最高，增加6.06倍，具体结果见图3.

2.3 嗜水气单胞菌攻毒对表皮MnSerpin表达的影响

嗜水气单胞菌对表皮MnSerpin的诱导效应出现在攻毒后6～48 h.如图4，与同时刻对照组相比，攻毒后6～48 h，MnSerpin的相对表达量极显著增加，6 h达到峰值，升高了3.77倍（P＜0.01）.

2.4 dsRNA对MnSerpin的干扰效率

注射dsRNA能显著降低MnSerpin的表达.与相应的对照组比，6～72 h，干扰组MnSerpin的转录水平极显著降低，12 h获得最大干扰率为58%（P＜0.01，图5）.

2.5 MnSerpin干扰后嗜水气单胞菌攻毒对日本沼虾死亡率的影响

dsRNA干扰后嗜水气单胞菌攻毒可导致日本沼虾死亡率明显增加.攻毒后120 h，攻毒+未干扰组日本沼虾的累计死亡率为58%，而对照组仅为2%.攻毒后24 h，攻毒+干扰组日本沼虾累计死亡率开始显著增加，至120 h，比攻毒+未干扰组增加16%（P＜0.01，图6）.

3 讨 论

在本研究中，日本沼虾表皮MnSerpin有21个氨基酸残基组成的信号肽和含有RCL的保守Serpin结构域，符合典型Serpin家族结构特征，与三疣梭子蟹^［13］、中华绒螯蟹^［20］和中国明对虾^［11］等Serpin研究一致.从系统进化树分析可知，MnSerpin的氨基酸序列与中国对虾Serpin聚为一小支，亲缘关系最近.MnSerpin mRNA的组织分布较广，除了表皮，还包括鳃、胃等多种组织，与凡纳滨对虾^［8］、三疣梭子蟹^［13］和中华绒螯蟹^［21］的Serpin组织表达特征类似.在蜕皮周期中，表皮MnSerpin在蜕皮前晚期和蜕皮后早期呈高表达，推测可能与表皮上皮细胞活性的变化有关^［22］.

据报道，不同甲壳动物Serpin对病原微生物的应答反应并不一致.哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）攻毒后48 h内，斑节对虾血细胞Serpin基因转录水平没有增加^［23］；凡隆气单胞菌（Aeromonas veronii）攻毒后6～72 h内，红螯螯虾（Cherax quadricarinatus）肝胰腺Serpin转录水平极显著增加；鳗弧菌（Vibrio anguillarum）等攻毒后48 h内，凡纳滨对虾5种Serpin在血细胞或肝胰腺等组织表达量增加^［24-25］，本文也獲得了与凡纳滨对虾相似的结果（图4），表明表皮MnSerpin可能参与了机体应对嗜水气单胞菌感染的免疫应答.细菌等病原微生物可以诱导黑化，引起丝氨酸蛋白酶的增加.据报道，dsRNA抑制凡纳滨对虾肝胰腺Serpin表达后鳗弧菌攻毒，丝氨酸蛋白酶和虾的累积死亡率显著增加^［8］，本文也获得了类似的结果，敲降表皮MnSerpin的转录水平，嗜水气单胞菌攻毒明显增加了日本沼虾的死亡率（图6），推测MnSerpin表达的抑制导致丝氨酸蛋白酶过表达，产生过量黑化中间产物等增加了对宿主的损害.

综上，本文首次从日本沼虾表皮克隆了MnSerpin cDNA全长序列，MnSerpin在不同组织均有表达，在A期表皮表达量最高；嗜水气单胞菌攻毒能显著增加C期表皮MnSerpin转录水平，敲降MnSerpin的转录水平再攻毒能明显提高日本沼虾的死亡率.源自表皮的MnSerpin是日本沼虾重要的免疫因子.

附录见电子版（DOI：10.16366/j.cnki.1000-2367.2022.10.29.0001）.

参 考 文 献

［1］YANG H，JI T W，XIONG H R，et al.A trypsin-like serine protease domain of masquerade gene in crayfish Procambarus clarkii could activate prophenoloxidase and inhibit bacterial growth［J］.Developmental and Comparative Immunology，2021，117：103980.

［2］CERENIUS L，S?DERH?LL K.Immune properties of invertebrate phenoloxidases［J］.Developmental and Comparative Immunology，2021，122：104098.

［3］ZHANG D M，WAN W S，KONG T T，et al.A clip domain serine protease regulates the expression of proPO and hemolymph clotting in mud crab，Scylla paramamosain［J］.Fish & Shellfish Immunology，2018，79：52-64.

［4］ZHUANG X N，LUAN Y Y，LV T R，et al.PAP1 activates the prophenoloxidase system against bacterial infection in Musca domestica［J］.Developmental & Comparative Immunology，2021，124：104184.

［5］WANG L L，LIU H W，FU H Y，et al.Silkworm serpin32 functions as a negative-regulator in prophenoloxidase activation［J］.Developmental and Comparative Immunology，2019，91：123-131.

［6］ESZTERBAUER E，SZEG?D，URSU K，et al.Serine protease inhibitors of the whirling disease parasite Myxobolus cerebralis（Cnidaria，Myxozoa）：expression profiling and functional predictions［J］.PLoS One，2021，16（3）：e0249266.

［7］LIU Y J，HOU F J，QIAN Z Y，et al.Functional characterization of the clade B serine protease inhibitor SerpinB3 in the Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei［J］.Developmental & Comparative Immunology，2018，85：10-17.

［8］LIU Y J，SUN Y H，WANG Q A，et al.Identification and functional characterizations of serpin8，a potential prophenoloxidase-activating protease inhibitor in Pacific white shrimp，Litopenaeus vannamei［J］.Fish & Shellfish Immunology，2017，60：492-501.

［9］WANG Y，YANG F，CAO X L，et al.Hemolymph protease-5 links the melanization and Toll immune pathways in the tobacco hornworm，Manduca sexta［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2020，117（38）：23581-23587.

［10］HOMVISES T，TASSANAKAJON A，SOMBOONWIWAT K.Penaeus monodon SERPIN，PmSERPIN6，is implicated in the shrimp innate immunity［J］.Fish & Shellfish Immunology，2010，29（5）：890-898.

［11］LIU Y，LI F，WANG B，et al.A Serpin from Chinese shrimp Fenneropenaeus chinensis is responsive to bacteria and WSSV challenge［J］.Fish & Shellfish Immunology，2009，26（3）：345-351.

［12］蓋云超.中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）cDNA文库的构建、EST分析及其酚氧化酶系统关键基因的研究［D］.青岛：中国科学院海洋研究所，2009.

GAI Y C.Construction of cDNA library of Eriocheir sinensis，EST analysis and study on key genes of phenoloxidase system［D］.Qingdao：Institute of Oceanology，Chinese Academy of Sciences，2009.

［13］WANG S Y，CUI Z X，LIU Y A，et al.Identification and characterization of a serine protease inhibitor（PtSerpin）in the swimming crab Portunus trituberculatus［J］.Fish & Shellfish Immunology，2012，32（4）：544-550.

［14］ZHAO Y R，XU Y H，JIANG H S，et al.Antibacterial activity of serine protease inhibitor 1 from kuruma shrimp Marsupenaeus japonicus［J］.Developmental and Comparative Immunology，2014，44（2）：261-269.

［15］KOSTIN N N，BOBIK T V，SHURDOVA E M，et al.Cloning and characterization of serpin from red king crab Paralithodes camtschaticus［J］.Fish & Shellfish Immunology，2018，81：99-107.

［16］WANG W F，YANG H，LIU F，et al.A novel effect of imidazole derivative KK-42 on increasing survival of Aeromonas hydrophila challenged prawn Macrobrachium nipponense［J］.Fish & Shellfish Immunology，2013，34（1）：167-172.

［17］杜娟，張俊芳，岳凯迪，等.咪唑类物质KK-42对日本沼虾表皮矿化的影响［J］.河南师范大学学报（自然科学版），2023，51（1）：144-148.

DU J，ZHANG J F，YUE K D，et al.Effect of imidazole derivative KK-42 on mineralization of the cuticle in Macrobrachium nipponense［J］.Journal of Henan Normal University（Natural Science Edition），2023，51（1）：144-148.

［18］CHEN Q Y，ZHANG Z R，TANG H Y，et al.Aeromonas hydrophila associated with red spot disease in Macrobrachium nipponense and host immune-related gene expression profiles［J］.Journal of Invertebrate Pathology，2021，182：107584.

［19］KIRIRAT P，PROMWIKORN W，THAWEETHAMSEWEE P.Index of molt staging in the black tiger shrimp（Penaeus monodon）［J］.Songklanakarin Journal of Science and Technology，2004，26（5）：765-772.

［20］WANG L L，MA Z P，YANG J L，et al.Identification and characterization of a serine protease inhibitor Esserpin from the Chinese mitten crab Eriocheir sinensis［J］.Fish & Shellfish Immunology，2013，34（6）：1576-1586.

［21］LI Q，LIU L H，WANG Y，et al.Characterization and expression analysis of serpins in the Chinese mitten crab Eriocheir sinensis［J］.Gene，2016，575（2）：632-640.

［22］ZHENG Y P，HE W Y，B?LIVEAU C，et al.Cloning，expression and characterization of four serpin-1 cDNA variants from the spruce budworm，Choristoneura fumiferana［J］.Comparative Biochemistry and Physiology Part B：Biochemistry and Molecular Biology，2009，154（2）：165-173.

［23］LIU Y J，HOU F J，HE S L，et al.Identification，characterization and functional analysis of a serine protease inhibitor（Lvserpin）from the Pacific white shrimp，Litopenaeus vannamei［J］.Developmental and Comparative Immunology，2014，43（1）：35-46.

［24］LIU Y J，LIU T，HOU F J，et al.Lvserpin3 is involved in shrimp innate immunity via the inhibition of bacterial proteases and proteases involved in prophenoloxidase system［J］.Fish & Shellfish Immunology，2016，48：128-135.

［25］LIU Y J，HOU F J，WANG X Z，et al.Recombinant expression and characterization of a serine protease inhibitor（Lvserpin7）from the Pacific white shrimp，Litopenaeus vannamei［J］.Fish & Shellfish Immunology，2015，42（2）：256-263.

Cloning and preliminary study on immune function of Serpin gene from the epidermis of Macrobrachium nipponense

Ning Qianji， Peng Yanxin， Yue Kaidi， Li Yijun

（College of Life Sciences， Henan Normal University， Xinxiang 453007， China）

Abstract： Melanization mediated by serine protease cascade reaction is an important immune response of crustaceans in which serine proteinase inhibitor（serpin）are important regulators. However， crustacean epidermal serpin is rarely studied. In order to explore the function of epidermal serpin in the immune response of Macrobrachium nipponense， a new serpin gene， named MnSerpin， was firstly cloned and identified from epidermis using PCR and RACE based on previous transcriptome data. Bioinformatics， RT-qPCR and RNAi methods were used to study the gene sequence characteristics， spatial and temporal expression pattern， transcription level of epidermal MnSerpin and mortality of shrimps after Aeromonas hydrophila challenge. The results showed that the full length of MnSerpin cDNA was 2 181 bp， encoding 419 amino acids， which formed a serpin domain. MnSerpin was expressed in abdominal epidermis， gill， hemocyte， stomach， heart and hepatopancreas. The expression level of MnSerpin in epidermis was related to the molting cycle. Compared with the intermolt stage（C stage）， it was the highest in the early postmolt stage（A stage）and increased by 6.06 times（P＜0.01）. After A. hydrophila challenge， the relative expression of MnSerpin in epidermis reached the peak after 6 h， and increased by 3.77 times compared with the control group（P＜0.01）. 3 μg of dsRNA solution was injected into the abdominal second segment articular membrane every 12 h， 3 injections in total. Compared to control group， RNAi had the highest interference efficiency 12 h after the last injection， where the relative expression of epidermal MnSerpin decreased by 58%（P＜0.01）. Challenge at the time point with the highest interference efficiency and within 120 h， the cumulative mortality of shrimps increased by 16% compared with the non-RNAi-challenged group（P＜0.01）. The results showed that MnSerpin from the epidermis of M. nipponense was an important immune factor， its expression was different in tissues and stages of molting cycle， and its down-regulation could significantly increase the mortality of shrimp infected with A.hydrophila.

Keywords： Macrobrachium nipponense; epidermis; MnSerpin; RNAi

［責任编校 刘洋 杨浦］