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酸水解提高绞股蓝皂苷XLVI抗肝癌活性的研究

2024-04-19郑志忠郑溢明艳林1福建省亚热带植物研究所福建省亚热带植物生理生化重点实验室福建厦门361006厦门华侨亚热带植物引种园厦门市引种检疫与植物源产物重点实验室福建厦门36100福州理工学院生命科学与健康学院福建福州350506

首都食品与医药 2024年8期
关键词:糖基细胞毒绞股蓝

郑志忠,郑溢,明艳林1,△(1.福建省亚热带植物研究所,福建省亚热带植物生理生化重点实验室,福建 厦门 361006;.厦门华侨亚热带植物引种园,厦门市引种检疫与植物源产物重点实验室,福建 厦门 36100;3.福州理工学院,生命科学与健康学院,福建 福州 350506)

绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum)也被誉为“南方人参”[1],是一种可用于保健食品的中药(见图1)。绞股蓝属于葫芦科、绞股蓝属的草本攀援植物,因其在医药和健康领域具有多种功效而被广泛研究应用。其主要分布于东南亚等地以及我国秦岭及长江以南地区,大多生长在海拔300-3200米的山谷密林等地方。研究[2]表明,绞股蓝具有多种药理作用,包括抗癌防癌、调节免疫系统、减少外界有害物质对机体器官造成的损害、活化人体正常细胞、解疲劳、健脾胃、延缓衰老等。此外,绞股蓝的品种历史悠久,市场开发潜力巨大,产业发展前景广阔。根据绞股蓝的诸多功效、品种历史,市场开发及产业发展等情况,绞股蓝于2016年成功入选“福九味”行业品牌闽产药材品种名单,进一步确立了其在中药材市场中的地位[3]。

图1 绞股蓝

绞股蓝皂苷(Gypenoside,Gyp)是绞股蓝的主要活性成分,因其骨架结构是达玛烷型四环三萜结构,与人参皂苷的骨架结构一致而成为多年来的研究热点。研究[2]表明,绞股蓝皂苷在抗衰老、抗肿瘤、降低血糖、降血脂、保护肝脏及神经保护等多方面具有生物活性。绞股蓝皂苷的C-3、C-6和C-20位置可以与不同的糖基进行键合形成苷类化合物。通过酸、碱、酶、微生物等方法,在加热、微波条件下会使侧链的糖基与苷元发生水解反应,失去部分或全部糖基,降解成相应的次级苷、苷元[4]。本课题组前期以福建绞股蓝为材料,利用灰绿曲霉微生物转化绞股蓝皂苷[5],以及利用柚皮苷酶进行酶转化绞股蓝皂苷XLVI,生成新的绞股蓝皂苷TN-1[6]。前期结果表明,在微生物体内或柚皮苷酶作用下,绞股蓝皂苷发生一系列代谢反应,导致绞股蓝皂苷侧链糖基分子减少,进而生物活性升高[7]。

为了解决灰绿曲霉等微生物发酵生产成本较高、工艺复杂以及柚皮苷酶易失活等问题,本研究采用酸水解技术来水解绞股蓝皂苷XLVI,以期获得绞股蓝皂苷TN-1,提高其抗肝癌活性。与现有技术相比,酸水解技术具有更高效和更彻底的水解效果,同时避免了使用微生物或酶进行转化,从而降低了生产成本和工艺复杂性。

1 材料

1.1实验材料 绞股蓝皂苷XLVI由本实验室前期自提;绞股蓝购自福建南靖地区;人参皂苷对照品IH901由山东省天然药物工程技术研究中心提供(纯度大于98%);人肝癌细胞(Bel7402、SMMC7721)、人正常肝细胞(Chang liver)均购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

1.2仪器与试剂 旋转蒸发仪(EYELA Corporation);液相色谱仪(Agilent 1200);核磁共振仪(AV2400 Bruker BioSpin);四甲基偶氮唑盐(MTT)购自生工生物工程(上海)有限公司;乙腈购自Merck公司,其他甲醇、盐酸、甲酸、硫酸、乙酸、酒石酸、丙二酸、正丁醇、乙酸乙酯等均为国产试剂。

2 方法

2.1绞股蓝皂苷XLVI的酸水解 取1mg绞股蓝皂苷XLVI溶于0.05 mL甲醇中,分别加入到0.25mL浓度为5%(m/v或v/v)的酸溶液(盐酸、甲酸、硫酸、乙酸、酒石酸、丙二酸),于60℃水浴锅中水解0.5h。反应结束时用0.2mL的2mol/L NaOH溶液中和终止酸水解,最后用0.5mL正丁醇进行萃取,正丁醇层用来薄层层析,展开剂为正丁醇∶乙酸乙酯∶水=4∶1∶5,并用5%硫酸乙醇加热显色,并计算Rf值。Rf值=溶质迁移距离/展开剂迁移距离。

2.2Sephadex LH-20柱层析 取100mg绞股蓝皂苷XLVI通过10%盐酸,70℃,1h水解制备绞股蓝XLVI的酸水解产物,NaOH溶液中和后的溶液用正丁醇分三次萃取,旋转蒸发仪蒸干。取水解样品进行葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析,依次加入100mL甲醇-水溶液(40%,50%,60%,70%,80%,90%,100%)进行梯度洗脱,收集洗脱液约15mL/管,从1开始编号。

2.3核磁共振鉴定结构 把待鉴定样品溶解于1mL的氘代甲醇,密封后于自然资源部第三海洋研究所的核磁共振仪中进行测试。测试项目包括1H-NMR和13C-NMR。

2.4MTT法检测细胞毒活性 将对数生长期的细胞用胰酶消化后计数,按照每孔2500个细胞接种入96孔板中,于37℃,5%CO2培养箱中培养24h。每孔中加入含有不同浓度药物的培养基200μL(绞股蓝皂苷XLVI为0μg/mL,25μg/mL,50μg/mL,100μg/mL,200μg/mL,400μg/mL;绞股蓝皂苷TN-1为0μg/mL,20μg/mL,40μg/mL,80μg/mL,100μg/mL)继续培养。空白组、加药组和对照组均设3组重复,见表1。

表1 MTT法检测细胞毒活性分组情况

经过药物处理48h后,每孔加20μL的MTT(5mg/mL)后置于37℃温育4h,终止培养,吸弃上清并加入150μL的DMSO使结晶物充分溶解,用微孔板快速振荡器振荡10min,最后用酶标仪测定570nm波长下的光吸收值A。细胞生长抑制率=(A对照组-A加药组)÷(A对照组-A空白组)×100%。

3 结果与讨论

3.1酸水解充分水解绞股蓝皂苷XLVI 将不同酸水解产物进行TLC薄层层析后,再用5%硫酸乙醇加热显色,最后通过Gel-PRO ANALYZER凝胶定量分析软件对薄层层析板进行灰度扫描;结果发现经过不同酸(盐酸、甲酸、硫酸、乙酸、酒石酸、丙二酸)的处理后,盐酸处理后的绞股蓝皂苷XLVI残留量比例最少,仅为7.58%,如表2和图2所示,盐酸和硫酸的水解效果较佳。考虑到浓硫酸的危险性,后续实验将采用盐酸进行。

图2 绞股蓝皂苷XLVI不同酸水解产物薄层层析。1:盐酸;2:甲酸;3:硫酸;4:乙酸;5:酒石酸;6:丙二酸

表2 不同酸对绞股蓝皂苷酸水解的影响

3.2酸水解产物的分离纯化 通过TLC薄层层析分析Sephadex LH-20柱层析的洗脱液,再根据TLC图谱的显色特征和Rf值合并洗脱液。结果如图3所示,绞股蓝皂苷XLVI经过盐酸的充分水解后,有3个产物:化合物A(编号8-13,Rf≈0.45)、化合物B(编号16-21,Rf≈0.70)、化合物C(编号24-29,Rf≈0.85)。其中化合物B的Rf值与绞股蓝皂苷TN-1基本相同,因此可以推测化合物B可能就是绞股蓝皂苷TN-1,并进一步通过核磁共振鉴定化合物结构。

图3 绞股蓝皂苷XLVI水解产物薄层层析。1:盐酸水解产物;2:绞股蓝皂苷XLVI;3:标准品

3.3化合物B的结构鉴定 化合物B:白色无定形粉末,易溶于甲醇;经查阅文献,该化合物碳谱数据和氢谱数据与文献报道一致[6],1H NMR(MeOH-d4):δH 4.62(1H,d,J=7.6,Glu H-1'),3.11(1H,t,J=8.2,Glu H-2'),3.34-3.36(2H,m,overlapped Glu H-3',4'),3.21(1H,m,Glu H-5'),3.79(1H,dd,J=2.2/12.3,Glu H-6'a),3.62(1H,dd,J=5.1/12.3,Glu H-6'b);13C NMR (MeOH-d4):96.9d(Glu C-1'),74.0(Glu C-2'),76.8(Glu C-3'),69.8(Glu C-4'),76.5(Glu C-5'),61.1(Glu C-6')。故确定该化合物为:绞股蓝皂苷TN-1,如图4所示。

图4 绞股蓝皂苷XLVI和绞股蓝皂苷TN-1的化学结构

3.4绞股蓝皂苷的细胞毒作用 通过MTT法测定绞股蓝皂苷XLVI和绞股蓝皂苷TN-1对人正常肝细胞Chang liver、人肝癌细胞SMMC7721、人肝癌细胞Bel7402的细胞毒作用,如表3所示。两种绞股蓝皂苷对体外培养的人肝癌细胞均有一定的抑制作用,但抑制程度并不相同。绞股蓝皂苷XLVI对细胞抑制作用相对较弱;而绞股蓝皂苷TN-1对肝癌细胞的抑制作用最大,半抑制浓度IC50分别为(36.65±12.31)μg/mL、(53.42±5.83)μg/mL,且对正常肝细胞Chang liver的细胞毒作用也相应增强,达到(47.7±11.59)μg/mL。

3.5肝癌细胞形态学观察 根据细胞毒结果进行形态学观察。如图5所示,对照组细胞饱满舒展,贴壁成片生长。绞股蓝皂苷XLVI和绞股蓝皂苷TN-1对Bel7402都具有明显的细胞毒作用,细胞数量显著减少,能够使细胞逐渐变圆,体积缩小,连接消失,与周围的细胞脱离,尤其是绞股蓝皂苷TN-1的细胞毒作用更为显著。

图5 两种绞股蓝皂苷对Bel7402细胞作用的形态观察

4 结论

自20世纪90年代以来,陆续有学者对绞股蓝皂苷进行酸水解研究,但主要是对绞股蓝总皂苷的酸水解进行报道[8-9],较少对单一绞股蓝皂苷的酸水解产物进行报道。盐酸水解模拟胃部酸性环境,可以脱去绞股蓝皂苷C-3、C-20位连接的糖基。脱去侧链糖基后的绞股蓝皂苷,分子量更小,也更容易被人体吸收[10]。本研究通过盐酸水解绞股蓝皂苷XLVI生成化合物A、化合物B和化合物C3个产物,可能分别对应着脱去3、2、1个侧链糖基后的绞股蓝皂苷。其中,化合物B经过鉴定,正好是脱去C-3上的2个糖基后的绞股蓝皂苷TN-1。

MTT法测定细胞毒活性和细胞形态学观察的结果均表明,绞股蓝皂苷XLVI经过盐酸水解后的产物,绞股蓝皂苷TN-1对肝癌细胞的细胞毒作用有着显著的增强。因此,酸水解能够提高绞股蓝皂苷抗肝癌活性的研究,为绞股蓝皂苷作为抗肝癌新药的开发利用提供了新的思路。但是本文中的酸水解条件比人体胃部酸性环境要严苛很多,单纯倚靠胃部消化无法达到本文中的酸水解效果;同时化合物A和化合物C的结构和生物活性也有待进一步研究。

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