酸水解提高绞股蓝皂苷XLVI抗肝癌活性的研究

郑志忠,郑溢,明艳林1,△（1.福建省亚热带植物研究所,福建省亚热带植物生理生化重点实验室,福建 厦门 361006;.厦门华侨亚热带植物引种园,厦门市引种检疫与植物源产物重点实验室,福建 厦门 36100;3.福州理工学院,生命科学与健康学院,福建 福州 350506）

绞股蓝（Gynostemma pentaphyllum）也被誉为“南方人参”[1]，是一种可用于保健食品的中药（见图1）。绞股蓝属于葫芦科、绞股蓝属的草本攀援植物，因其在医药和健康领域具有多种功效而被广泛研究应用。其主要分布于东南亚等地以及我国秦岭及长江以南地区，大多生长在海拔300-3200米的山谷密林等地方。研究[2]表明，绞股蓝具有多种药理作用，包括抗癌防癌、调节免疫系统、减少外界有害物质对机体器官造成的损害、活化人体正常细胞、解疲劳、健脾胃、延缓衰老等。此外，绞股蓝的品种历史悠久，市场开发潜力巨大，产业发展前景广阔。根据绞股蓝的诸多功效、品种历史，市场开发及产业发展等情况，绞股蓝于2016年成功入选“福九味”行业品牌闽产药材品种名单，进一步确立了其在中药材市场中的地位[3]。

图1 绞股蓝

绞股蓝皂苷（Gypenoside，Gyp）是绞股蓝的主要活性成分，因其骨架结构是达玛烷型四环三萜结构，与人参皂苷的骨架结构一致而成为多年来的研究热点。研究[2]表明，绞股蓝皂苷在抗衰老、抗肿瘤、降低血糖、降血脂、保护肝脏及神经保护等多方面具有生物活性。绞股蓝皂苷的C-3、C-6和C-20位置可以与不同的糖基进行键合形成苷类化合物。通过酸、碱、酶、微生物等方法，在加热、微波条件下会使侧链的糖基与苷元发生水解反应，失去部分或全部糖基，降解成相应的次级苷、苷元[4]。本课题组前期以福建绞股蓝为材料，利用灰绿曲霉微生物转化绞股蓝皂苷[5]，以及利用柚皮苷酶进行酶转化绞股蓝皂苷XLVI，生成新的绞股蓝皂苷TN-1[6]。前期结果表明，在微生物体内或柚皮苷酶作用下，绞股蓝皂苷发生一系列代谢反应，导致绞股蓝皂苷侧链糖基分子减少，进而生物活性升高[7]。

为了解决灰绿曲霉等微生物发酵生产成本较高、工艺复杂以及柚皮苷酶易失活等问题，本研究采用酸水解技术来水解绞股蓝皂苷XLVI，以期获得绞股蓝皂苷TN-1，提高其抗肝癌活性。与现有技术相比，酸水解技术具有更高效和更彻底的水解效果，同时避免了使用微生物或酶进行转化，从而降低了生产成本和工艺复杂性。

1 材料

1.1实验材料 绞股蓝皂苷XLVI由本实验室前期自提；绞股蓝购自福建南靖地区；人参皂苷对照品IH901由山东省天然药物工程技术研究中心提供（纯度大于98%）；人肝癌细胞（Bel7402、SMMC7721）、人正常肝细胞（Chang liver）均购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

1.2仪器与试剂 旋转蒸发仪（EYELA Corporation）；液相色谱仪（Agilent 1200）；核磁共振仪（AV2400 Bruker BioSpin）；四甲基偶氮唑盐（MTT）购自生工生物工程（上海）有限公司；乙腈购自Merck公司，其他甲醇、盐酸、甲酸、硫酸、乙酸、酒石酸、丙二酸、正丁醇、乙酸乙酯等均为国产试剂。

2 方法

2.1绞股蓝皂苷XLVI的酸水解 取1mg绞股蓝皂苷XLVI溶于0.05 mL甲醇中，分别加入到0.25mL浓度为5%（m/v或v/v）的酸溶液（盐酸、甲酸、硫酸、乙酸、酒石酸、丙二酸），于60℃水浴锅中水解0.5h。反应结束时用0.2mL的2mol/L NaOH溶液中和终止酸水解，最后用0.5mL正丁醇进行萃取，正丁醇层用来薄层层析，展开剂为正丁醇∶乙酸乙酯∶水=4∶1∶5，并用5%硫酸乙醇加热显色，并计算Rf值。Rf值=溶质迁移距离/展开剂迁移距离。

2.2Sephadex LH-20柱层析 取100mg绞股蓝皂苷XLVI通过10%盐酸，70℃，1h水解制备绞股蓝XLVI的酸水解产物，NaOH溶液中和后的溶液用正丁醇分三次萃取，旋转蒸发仪蒸干。取水解样品进行葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析，依次加入100mL甲醇-水溶液（40%，50%，60%，70%，80%，90%，100%）进行梯度洗脱，收集洗脱液约15mL/管，从1开始编号。

2.3核磁共振鉴定结构 把待鉴定样品溶解于1mL的氘代甲醇，密封后于自然资源部第三海洋研究所的核磁共振仪中进行测试。测试项目包括1H-NMR和13C-NMR。

2.4MTT法检测细胞毒活性 将对数生长期的细胞用胰酶消化后计数，按照每孔2500个细胞接种入96孔板中，于37℃，5%CO2培养箱中培养24h。每孔中加入含有不同浓度药物的培养基200μL（绞股蓝皂苷XLVI为0μg/mL，25μg/mL，50μg/mL，100μg/mL，200μg/mL，400μg/mL；绞股蓝皂苷TN-1为0μg/mL，20μg/mL，40μg/mL，80μg/mL，100μg/mL）继续培养。空白组、加药组和对照组均设3组重复，见表1。

表1 MTT法检测细胞毒活性分组情况

经过药物处理48h后，每孔加20μL的MTT（5mg/mL）后置于37℃温育4h，终止培养，吸弃上清并加入150μL的DMSO使结晶物充分溶解，用微孔板快速振荡器振荡10min，最后用酶标仪测定570nm波长下的光吸收值A。细胞生长抑制率=（A对照组-A加药组）÷（A对照组-A空白组）×100%。

3 结果与讨论

3.1酸水解充分水解绞股蓝皂苷XLVI 将不同酸水解产物进行TLC薄层层析后，再用5%硫酸乙醇加热显色，最后通过Gel-PRO ANALYZER凝胶定量分析软件对薄层层析板进行灰度扫描；结果发现经过不同酸（盐酸、甲酸、硫酸、乙酸、酒石酸、丙二酸）的处理后，盐酸处理后的绞股蓝皂苷XLVI残留量比例最少，仅为7.58%，如表2和图2所示，盐酸和硫酸的水解效果较佳。考虑到浓硫酸的危险性，后续实验将采用盐酸进行。

图2 绞股蓝皂苷XLVI不同酸水解产物薄层层析。1：盐酸；2：甲酸；3：硫酸；4：乙酸；5：酒石酸；6：丙二酸

表2 不同酸对绞股蓝皂苷酸水解的影响

3.2酸水解产物的分离纯化 通过TLC薄层层析分析Sephadex LH-20柱层析的洗脱液，再根据TLC图谱的显色特征和Rf值合并洗脱液。结果如图3所示，绞股蓝皂苷XLVI经过盐酸的充分水解后，有3个产物：化合物A（编号8-13，Rf≈0.45）、化合物B（编号16-21，Rf≈0.70）、化合物C（编号24-29，Rf≈0.85）。其中化合物B的Rf值与绞股蓝皂苷TN-1基本相同，因此可以推测化合物B可能就是绞股蓝皂苷TN-1，并进一步通过核磁共振鉴定化合物结构。

图3 绞股蓝皂苷XLVI水解产物薄层层析。1：盐酸水解产物；2：绞股蓝皂苷XLVI；3：标准品

3.3化合物B的结构鉴定 化合物B：白色无定形粉末，易溶于甲醇；经查阅文献，该化合物碳谱数据和氢谱数据与文献报道一致[6]，1H NMR（MeOH-d4）：δH 4.62（1H，d，J=7.6，Glu H-1'），3.11（1H，t，J=8.2，Glu H-2'），3.34-3.36（2H，m，overlapped Glu H-3'，4'），3.21（1H，m，Glu H-5'），3.79（1H，dd，J=2.2/12.3，Glu H-6'a），3.62（1H，dd，J=5.1/12.3，Glu H-6'b）；13C NMR （MeOH-d4）：96.9d（Glu C-1'），74.0（Glu C-2'），76.8（Glu C-3'），69.8（Glu C-4'），76.5（Glu C-5'），61.1（Glu C-6'）。故确定该化合物为：绞股蓝皂苷TN-1，如图4所示。

图4 绞股蓝皂苷XLVI和绞股蓝皂苷TN-1的化学结构

3.4绞股蓝皂苷的细胞毒作用 通过MTT法测定绞股蓝皂苷XLVI和绞股蓝皂苷TN-1对人正常肝细胞Chang liver、人肝癌细胞SMMC7721、人肝癌细胞Bel7402的细胞毒作用，如表3所示。两种绞股蓝皂苷对体外培养的人肝癌细胞均有一定的抑制作用，但抑制程度并不相同。绞股蓝皂苷XLVI对细胞抑制作用相对较弱；而绞股蓝皂苷TN-1对肝癌细胞的抑制作用最大，半抑制浓度IC50分别为（36.65±12.31）μg/mL、（53.42±5.83）μg/mL，且对正常肝细胞Chang liver的细胞毒作用也相应增强，达到（47.7±11.59）μg/mL。

3.5肝癌细胞形态学观察 根据细胞毒结果进行形态学观察。如图5所示，对照组细胞饱满舒展，贴壁成片生长。绞股蓝皂苷XLVI和绞股蓝皂苷TN-1对Bel7402都具有明显的细胞毒作用，细胞数量显著减少，能够使细胞逐渐变圆，体积缩小，连接消失，与周围的细胞脱离，尤其是绞股蓝皂苷TN-1的细胞毒作用更为显著。

图5 两种绞股蓝皂苷对Bel7402细胞作用的形态观察

4 结论

自20世纪90年代以来，陆续有学者对绞股蓝皂苷进行酸水解研究，但主要是对绞股蓝总皂苷的酸水解进行报道[8-9]，较少对单一绞股蓝皂苷的酸水解产物进行报道。盐酸水解模拟胃部酸性环境，可以脱去绞股蓝皂苷C-3、C-20位连接的糖基。脱去侧链糖基后的绞股蓝皂苷，分子量更小，也更容易被人体吸收[10]。本研究通过盐酸水解绞股蓝皂苷XLVI生成化合物A、化合物B和化合物C3个产物，可能分别对应着脱去3、2、1个侧链糖基后的绞股蓝皂苷。其中，化合物B经过鉴定，正好是脱去C-3上的2个糖基后的绞股蓝皂苷TN-1。

MTT法测定细胞毒活性和细胞形态学观察的结果均表明，绞股蓝皂苷XLVI经过盐酸水解后的产物，绞股蓝皂苷TN-1对肝癌细胞的细胞毒作用有着显著的增强。因此，酸水解能够提高绞股蓝皂苷抗肝癌活性的研究，为绞股蓝皂苷作为抗肝癌新药的开发利用提供了新的思路。但是本文中的酸水解条件比人体胃部酸性环境要严苛很多，单纯倚靠胃部消化无法达到本文中的酸水解效果；同时化合物A和化合物C的结构和生物活性也有待进一步研究。