胰岛素样生长因子2基因在A型主动脉夹层组织中的表达研究

王海涛 蒋丁胜 方泽民

A型主动脉夹层(type A aortic dissection,TAAD)是一种心血管急危重症,病人需要得到快速的诊断和治疗[1]。目前,针对TAAD的治疗方法主要依靠外科手术,缺乏行之有效的保守治疗方案以及预防筛选方案。TAAD的发病机制涉及多种病理生理过程,且其中的分子机制尚未完全阐明。胰岛素样生长因子2(insulin like growth factor 2,IGF2)是系统发育过程中经典的胰岛素/ IGF信号轴的组成部分,在调节细胞的生存、生长和增殖以及代谢方面均发挥重要作用[2]。IGF2表达的异常增多在乳腺癌、肝癌、肺癌等癌症研究中均有报道[3],但IGF2在心血管疾病领域研究较少。本研究探讨IGF2在TAAD中的表达情况及其临床意义。

对象与方法

一、对象

2015年1月～2019年12月我院行升主动脉置换术的TAAD病人9例(夹层组)和心脏移植供体修剪下来主动脉5例(对照组),标本均取用升主动脉部分。纳入标准:夹层组入院后行主动脉血管增强CT(CTA)确诊为TAAD。排除标准:均排除合并马凡综合征、创伤性夹层、肿瘤、风湿性疾病、传染性疾病等。本研究获得我院伦理委员会批准并获得知情同意书。

二、方法

1.术中所获组织分生标本组立即切割为1.0 cm3的组织块,并立即转移至细胞冻存管中后经液氮速冻,-80 ℃冰箱中保存备用。病理标本放入4%甲醛溶液中室温保存,经过脱水、固定、石蜡包埋等处理,并将主动脉壁病理标本切为5 μm厚的石蜡切片。

2.苏木精-伊红(HE)染色:切片脱蜡水合后经苏木素染色,1%的盐酸酒精分化,Scott液染色,伊红染液染色。再将切片依次放入95%酒精Ⅰ ,95%酒精Ⅱ,无水乙醇Ⅰ ,无水乙醇Ⅱ,二甲苯Ⅰ ,二甲苯Ⅱ中脱水透明,最后将切片从二甲苯拿出来稍晾干,中性树胶封片,显微镜下观察拍照。

3.弹性纤维(EVG)染色:将切片脱蜡水合后放入高锰酸钾,接着放入Elastin染液中浸染过夜,再用95%乙醇浸泡2次。放入Van Gieson染液,后经梯度乙醇脱水,封片后显微镜下观察拍照。

4.蛋白质免疫印迹法(Western Blot):取冻存的组织块研磨后用现配制的裂解液(RIPA∶PMSF=100∶1)裂解后超声。将所得蛋白样品使用BCA蛋白质定量试剂盒(Thermo Fisher scientific,23227)测定总蛋白质浓度。将蛋白质变性后每组蛋白样品按20 μg进行SDS-PAGE凝胶电泳并转移到PVDF膜上,使用5%脱脂牛奶(5 g脱脂奶粉∶1 000 ml TBST)室温封闭1小时后用TBST洗膜后置于含有相应一抗的抗体稀释液(IGF2,1∶100,ATLAS,HPA007556)中于4 ℃冰箱孵育过夜。用TBST洗膜,然后使用相应二抗室温孵育2小时,再次使用TBST洗膜。加入显影液,使用Chemi Doc TMXRS+成像系统(BioRad)显影成像,使用Image Lab软件测定条带中蛋白质的相对表达量。

5.免疫组化染色:切片脱蜡、水合后进行EDTA抗原修复。用3%的H2O2消除内源性过氧化物酶,PBS漂洗。滴加5%BSA封闭。去除BSA,滴加50 μl一抗(IGF2,1∶100,ATLAS,HPA007556),4 ℃孵育过夜后,PBS漂洗。滴加反应增强液37 ℃孵育,PBS漂洗。滴加二抗孵育,PBS洗3次。滴加现配DAB工作液染色,PBS漂洗。苏木素复染、盐酸酒精分化。切片脱水透明。中性树脂封片,采集图像,使用Image J软件进行分析。

三、统计学分析

结果

1.HE染色:对照组主动脉结构完整,血管平滑肌细胞排列整齐,细胞呈长梭形,胞质丰富,细胞核深染;夹层组主动脉壁中平滑肌细胞皱缩且排列紊乱,胞核变小且胞质染色变浅,细胞形态发生改变并伴有数量的下降。见图1A、B。

A 对照组 HE染色,可见主动脉壁结构规整,主动脉平滑肌细胞排列有序。B 夹层组,可见主动脉壁结构退变,主动脉平滑肌细胞排列紊乱。C 对照组,主动脉壁弹力纤维完整紧密。D 夹层组,主动脉壁弹力纤维断裂、丢失

2.EVG染色:对照组主动脉中弹力纤维完整连续,排列紧密有序,夹层组主动脉壁中弹性纤维染色变浅,弹力纤维排列疏松,纤维变细且断裂增加。见图1C、D。

3.IGF2蛋白水平在主动脉夹层组织和正常组织中的差异表达:Western Blot检测结果显示,正常组织表达量为1.000±0.370,主动脉夹层组织中IGF2蛋白相对表达量(夹层组)为0.229±0.148),差异有统计学意义(P<0.05,图2)。提示IGF2可能在维持主动脉正常的结构和功能方面发挥重要作用,而主动脉壁组织中如果缺乏IGF2,则可能导致主动脉的结构发生紊乱和功能发生异常,甚至导致夹层发生发展。

图2 两组主动脉壁组织中IGF2蛋白表达及定量(P<0.05)

IGF2阳性表达为棕色,可见A对照组中IGF2表达显著高于B夹层组

4.免疫组化染色:IGF2主要在主动脉平滑肌细胞核中表达。对照组主动脉中可见大量平滑肌细胞核中深染的棕色颗粒(图3),Image J统计显示,对照组主动脉平滑肌细胞中IGF2相对表达量为13.87±1.21,夹层组为0.6167±0.210,两组比较差异有统计学意义(P<0.05,图3)。

讨论

主动脉夹层的形成是由高血压、遗传因素等多种因素导致主动脉内膜破裂,血液进入主动脉中膜形成真假腔,假腔的形成随时可能导致主动脉破裂危及病人的生命。关于主动脉夹层的病理机制,目前已知的主要包括平滑肌细胞丢失、细胞外基质紊乱、弹性纤维断裂、炎症细胞浸润等[4]。血管平滑肌细胞的丢失,通常认为是与平滑肌细胞增殖、凋亡功能异常有关。IGFs在各种组织器官的生长促进中发挥着关键的自分泌、旁分泌和内分泌作用,调节细胞增殖、分化和凋亡[5]。IGF2是胰岛素/IGF系统中的一部分,该系统由胰岛素、IGFs、IGF受体(IGFRs)、IGF结合蛋白(IGFBPs)及相关蛋白酶组成[3]。IGF2在多种器官和组织中广泛表达,并在组织中发挥特异性作用。有研究表明,IGF2在癌细胞中表达上调,可增强其生存和侵袭能力,主要通过结合IGF1R激活下游通路发挥生物学作用,促进细胞增殖,抑制细胞凋亡[6]。还有研究表明,IGF2可以增加参与血管生成的基因的表达,以此通过增加癌症细胞的血液供应来促进肿瘤的生长和扩散[7]。虽然对IGF2与心血管疾病相关的研究有限,但一些研究表明,IGF2水平可能与CVD风险增加有关。

血管平滑肌细胞增殖维持主动脉壁内血管平滑肌的数量,可以起到保护作用并延缓主动脉瘤和主动脉夹层的发展[8]。IGF2可以促进动脉血管平滑肌细胞的生长和增殖,通过下调IGF2可以抑制血管平滑肌细胞的增殖和迁移[9]。IGF2通过与平滑肌细胞表面的IGFR1结合,激活了刺激细胞周期和促进细胞增殖的信号通路,增加参与细胞周期进展和DNA合成的基因的表达,促进细胞增殖。IGF2在血管生成中的作用也被揭示。尖端细胞是一种由促血管生成因子诱导的内皮细胞的转导表型,在引导新生血管生成方面发挥重要作用。有研究发现,IGF2对维持尖端细胞十分重要[10]。IGF2的敲除通过抑制人脐静脉内皮细胞的发芽,以及IGFBP3和IGFBP4通过对IGF2-IGFR1进行调控继而影响新生血管的生成[11]。

细胞凋亡是程序性细胞死亡的过程,对组织器官的发育和维持正常结构至关重要。在主动脉夹层病人样本中,促进凋亡的Bcl-2家族蛋白(Bax)上调,而抑制凋亡的Bcl-2家族蛋白(Bcl-2)下调,提示凋亡增强是主动脉夹层发生的重要过程[12]。IGF2在调节细胞凋亡中也发挥作用。有研究表明,IGF2通过抑制细胞凋亡来促进细胞存活。如在神经退行性疾病的动物模型中,IGF2已被证明可以通过激活PI3K/AKT/CREB信号通路保护海马体免受细胞凋亡[13]。在癌症细胞中,IGF2已被证明通过抑制凋亡来促进细胞存活和对化疗的抵抗。有关IGF2 mRNA结合蛋白3(IGF2BP3)的研究显示,在IGF2BP3敲除后,细胞IGF2蛋白减少且受辐射诱导的细胞凋亡增加,在将重组IGF2应用于培养物后恢复了细胞对凋亡的抵抗力[14]。敲低IGF2可以提高氧化低密度脂蛋白刺激的血管平滑肌细胞的细胞凋亡水平[15]。可见IGF2在抵抗细胞凋亡中发挥了重要作用。

本研究存在一定局限性。对照组来源于未患有主动脉疾病的心脏移植供体捐献者,缺少主动脉CTA检查结果,也缺少主动脉直径相关数据。因此,未能进行IGF2表达量与主动脉直径关系的相关分析。

本研究发现,IGF2在主动脉夹层病人主动脉壁组织中的表达量显著降低,IGF2的下调可能减弱了平滑肌细胞的增殖能力,增加了平滑肌细胞凋亡,进而使得主动脉血管中层结构不能维持,最终引发主动脉夹层。但对于IGF2的调控机制,以及是否通过促进血管平滑肌细胞增殖或者抵抗平滑肌细胞凋亡发挥保护作用,仍需要进一步研究探讨。IGF2经过深入地研究有望成为预防和治疗主动脉夹层的靶点。

利益冲突 所有的作者声明没有利益冲突

作者贡献 王海涛:标本收集、研究实施、文章撰写;蒋丁胜:实验设计、文章批阅;方泽民:标本收集、文章批阅、经费支持