单细胞转录组测序在肿瘤浸润免疫细胞中的研究进展

杜启联 宋恩峰 胡钦勇

肿瘤浸润免疫细胞是指浸润肿瘤及周围组织的免疫细胞,随肿瘤进展及治疗发生动态改变,但其亚群组成和功能目前尚不完全清楚。传统转录组测序技术受限于无法区分细胞亚群异质性及样本规模较小等缺陷,不能详细分析数量少的免疫细胞如中性粒细胞,并且多用于前期实验的验证。单细胞转录组测序(single-cell RNA sequencing,scRNA-seq)能精确分析肿瘤浸润免疫细胞在不同阶段肿瘤中的免疫特征和功能状态。现就scRNA-seq在肿瘤浸润免疫细胞中的研究进展和临床应用做一综述。

一、单细胞转录组测序

scRNA-seq基本研究流程包括样本采集、单细胞分离、裂解、逆转录、互补DNA扩增、文库构建、高通量测序、数据处理及分析。

1.单细胞分离:scRNA-seq的关键在于快速、高效、准确地分离出高质量单细胞。目前常用方法中微流控技术因其样本消耗低、高灵敏度、费用经济的优点而广受欢迎[1]。基于液滴的微流控技术(微液滴)是目前scRNA-seq最常用的高通量测序平台,但微液滴受限于微孔直径且对样本要求高,新开发的单细胞核转录组测序把组织抽核后制备成单细胞核悬液进行转录组测序,可以完全捕获直径较大或易破碎细胞的RNA信息,也可以对冷冻样本测序[2]。

2.scRNA-seq测序技术:单细胞分离后,需尽快提取RNA,经逆转录、扩增后生成cDNA库。聚合酶链反应和体外转录扩增是构建稳定cDNA文库的方法,随后对文库进行测序。scRNA-seq测序方案主要分为两类:3'或5'端转录本测序和全长转录本测序。(1)3'或5'端转录本测序:2015年发现的Drop-seq和in Drop-seq开启了微液滴技术的时代[3],这两种基于液滴的技术通过带有条形码的磁珠分离单细胞且应用唯一分子标识符纠正偏差。目前scRNA-seq较为成熟的商用高通量测序平台——10×Genomics,在降低成本、耗时少的同时显著提高了细胞通量,已广泛应用于肿瘤研究[4]。为提高测序深度和基因检测的效率,Seq-Well和Seq-WellS3(第二链合成)相继被开发[5]。scRNA-seq费用随样本数量增加。在降低费用方面,单细胞组合索引测序(sci-RNA-seq)和Sci-Plex的组合模式对于大规模的筛选实验更加划算,但相对繁琐的操作会增加损伤细胞的风险[6]。综上所述,3'或5'端转录本测序方法总体成本较低,能分析多重样本但灵敏度相对较低,主要用于基因表达的定量。(2)全长转录本测序:Smart-seq2 是scRNA-seq 分析的标准方法之一,能发现可变剪接事件和等位基因特异性表达,在其基础上开发了各有优劣的Smart-seq3和Smart-seq3xpress[7]。Hahaut等[8]在Smart-seq3系列的基础上开发了新的全长scRNA-seq方法,即FLASH-seq系列,能比Smart-seq3检测更多的DNA分子,在减少资源消耗的同时还可以使用唯一分子标识符纠正误差。然而,Smart-seq和FLASH-seq系列都不能测序细胞中所有RNA,如微小RNA。虽然测序过程仍然受到各种实际挑战,VASA-seq仍是目前唯一集高灵敏度、高效、高通量和全面覆盖总RNA于一体的新技术[9]。全长转录本测序转录组覆盖率较高,但费用和测序难度更高。

3.数据处理及分析:高通量测序后获得的大量数据需要高效的计算机系统进行处理和分析。一般分析流程包括质量控制、映射、标准化、聚类分析、后续分析。后续分析可进行基因本体论、基因富集分析、蛋白互作网络分析,还可以通过拟时序轨迹分析追溯细胞分化轨迹等。

二、单细胞转录组测序在肿瘤浸润免疫细胞中的应用潜力

1.发现新免疫细胞亚群及其功能:异质性是肿瘤微环境的主要特征之一,scRNA-seq 可在单个细胞层面发现新的肿瘤浸润免疫细胞亚群并明确其功能特征。scRNA-seq多应用于研究CD8+T细胞的免疫特征[10],但其他免疫细胞的功能表型同样重要。Hiroshi等[11]使用scRNA-seq对6例非小细胞肺癌肿瘤微环境进行分析,鉴定了一簇发挥抗肿瘤作用的CD4+T细胞新亚群——辅助T细胞7R,能预测肿瘤微环境的免疫状态和对程序性死亡受体1(PD-1)阻断剂的敏感性。辅助T细胞不同亚群和调节性T细胞之间的比例与免疫微环境的促瘤或抑瘤状态相关,可作为预测病人预后和免疫治疗疗效的标志物[12]。在一项霍奇金淋巴瘤的研究中,scRNA-seq确定了高表达LAG3 抑制受体的罕见调节性T细胞群体,是免疫抑制通路的介质且有助于免疫逃逸,该亚群常出现在主要组织相容性复合体(MHC)-Ⅱ阴性霍奇金淋巴瘤,与这种类型淋巴瘤病人不良预后相关。Chen等[13]在鼻咽癌中发现了一簇之前从未报道的表达CLEC9A髓样树突状细胞新亚群,CLEC9A+树突状细胞与能预测鼻咽癌病人预后的EB病毒DNA水平呈显著负相关,这可能是因为髓样树突状细胞受到活跃EB病毒复制的影响。由CLEC9A+树突状细胞等髓系免疫细胞构建的免疫特征与鼻咽癌病人生存结局的改善显着相关。scRNA-seq能鉴定与肿瘤发生发展相关的新免疫细胞亚群,强调了未来多靶点联合治疗肿瘤的必要性。

2.追踪肿瘤浸润免疫细胞分化谱系和分布特点:(1)免疫细胞谱系分化:细胞发育分化是一个动态过程,大多数实验技术只能捕捉细胞发育轨迹的瞬时状态。基于基因表达的级联变化等特征,scRNA-seq能展示不同免疫细胞的分化轨迹及其潜在机制。目前,scRNA-seq探索免疫细胞谱系分化的分析方法主要有两种,一种是RNA速度分析,原理是未剪接和剪接的 RNA 之间是否处于平衡状态可以作为基因是处于诱导状态还是抑制状态的一个指标;另一种是常用的拟时序分析,常用机器学习计算方法包括Monocle3 、SCORPIUS和TSCAN等,主要通过不同免疫细胞群体中的表达差异推测可能的分化轨迹[14]。肿瘤相关巨噬细胞亚群通过多种机制发挥促进或抑制肿瘤的作用,因此,肿瘤相关巨噬细胞分化轨迹对肿瘤进展意义重大。不同肿瘤的scRNA-seq研究证明肿瘤相关巨噬细胞经常同时表达经典的M1和M2基因[15-16]。拟时序分析发现,肿瘤相关巨噬细胞在M1(促炎)和M2(促肿瘤)表型之间相互转换。IRF2、IRF8、STAT2等转录因子可诱导巨噬细胞分化为抗肿瘤表型[17]。scRNA-seq还可以联合抗原T细胞受体(TCR)库进一步追踪T细胞发育轨迹。T细胞分化轨迹可通过不同状态细胞的TCR重叠率表示。例如,肿瘤浸润CD8+T细胞主要来源于干细胞样CD8+T细胞的局部扩增,scRNA-seq联合TCR测序在多种肿瘤中证明CD103+CD69+组织驻留记忆T细胞和GZMK+GZMA+效应记忆T细胞也能分化为肿瘤浸润CD8+T细胞,这两簇细胞从癌旁组织迁移至肿瘤组织后经常发生状态转换[18-20]。总之,肿瘤浸润免疫细胞的分化状态及其功能随肿瘤发生和转移动态改变,scRNA-seq可以多时间、多部位采集肿瘤微环境的免疫特征。(2)免疫细胞分布异质性:肿瘤浸润免疫细胞在肿瘤中的作用尚不完全清楚,挑战之一是不同肿瘤中免疫细胞的分布异质性显著。高分辨率的scRNA-seq可揭示不同组织中免疫细胞的分布特点。首先,肿瘤浸润免疫细胞在不同个体样本中分布不一致。肿瘤免疫微环境中幼稚状态、细胞毒性状态和功能障碍状态的CD8+T细胞相对丰度波动很大。在黑色素瘤不同样本的scRNA-seq研究中,耗竭T细胞可占到总T细胞浸润比例的5%至80% ,但一些低比例耗竭T细胞的样本中免疫抑制状态更明显[21]。其次,免疫细胞在不同肿瘤亚型中具有明显异质性。乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)阴性头颈部鳞状细胞癌的肿瘤浸润性B细胞更少。在一项鼻咽癌的scRNA-seq研究中,HPV阴性肿瘤样本中肿瘤中浸润的B细胞丰度甚至超过了T细胞[22]。通过scRNA-seq技术,He等[23]发现,血清AFP阳性(AFP≥20 ng/mL)比AFP阴性病人肿瘤微环境的免疫抑制程度更高,包括不同T细胞亚群的耗竭和SPP1+肿瘤相关巨噬细胞的积累,小鼠实验进一步证实AFP和SPP1+肿瘤相关巨噬细胞通过SPP1-CD44 轴促进T细胞耗竭。再次,免疫细胞在肿瘤组织和癌旁组织及正常组织的分布也不同。参与免疫抑制微环境形成的肿瘤浸润免疫细胞亚群,如耗竭T细胞、调节性T细胞、调节性B细胞、LAMP3+树突状细胞[11,24-27]等,在肿瘤组织中的浸润比例明显更高。最后,肿瘤浸润免疫细胞亚群具有时间特异性,在不同临床分期对肿瘤作用可能相反。scRNA-seq发现血浆样B细胞抑制早期非小细胞肺癌进展,但促进晚期肿瘤进展[26]。所以,scRNA-seq可推进肿瘤病人精准个体化治疗的发展。

3.探究泛癌中肿瘤浸润免疫细胞的共性和可塑性:泛癌研究是对多种肿瘤类型或亚型整合分析,旨在识别在异种肿瘤中共有或特异的特征,这些可能是由特定的分子机制驱动的。scRNA-seq是研究肿瘤浸润免疫细胞泛癌特征的强有力工具。T细胞肿瘤免疫微环境中数量最多的细胞群体。Zheng等[28]整合分析21种肿瘤类型共三百多例肿瘤、癌旁组织、外周血液样本中的T细胞发现,肿瘤反应T细胞主要是高异质性的耗竭T细胞、IFNG+卵泡辅助T细胞和TNFRSF9+调节性T细胞,其中TNFRSF9+调节性T细胞比例与免疫治疗成功率正相关。尽管不同肿瘤中肿瘤浸润T细胞异质性明显,但T细胞耗竭主要通过效应记忆T细胞和组织驻留记忆T细胞两条途径。研究人员根据预后情况把肿瘤样本分为两组:终末耗竭CD8+ T 细胞占比高组和组织驻留记忆CD8+ T 细胞占比高组,研究结果显示后者总体上生存时间更长。自然杀伤(NK)细胞在抑制肿瘤发生发展的先天免疫中的作用不可或缺。嵌合抗原受体-NK细胞治疗淋巴瘤和白血病取得了显著的临床成功。因为实体瘤中肿瘤浸润NK细胞了解并不全面,所以相应治疗在实体瘤中疗效有限。2023年8月,Tang等[29]收集整理分析了24种肿瘤病人和健康人NK细胞的scRNA-seq数据,首次在泛癌水平系统地鉴定到14类NK细胞亚群并详细分析了每个亚群的功能特征。研究者把表达杀伤性下降、抑制受体上升、高表达应激反应相关蛋白等功能失调特征的表型命名为肿瘤相关NK细胞,该细胞群富集在肿瘤组织中和LAMP3+树突状细胞相互作用,与多种癌症类型的不良预后及免疫治疗的耐药显著相关。这些肿瘤浸润免疫细胞的特征为临床治疗提供了重要参考[30]。总之,泛癌scRNA-seq揭示了异种肿瘤免疫细胞的共性及可塑性,为未来肿瘤免疫微环境相关研究提供了基线参考和潜在方向。

三、结语和展望

肿瘤浸润免疫细胞是影响肿瘤进展的主要因素之一。scRNA-seq不仅能确定免疫细胞亚群和功能特征,还能追踪细胞分化轨迹和分布及异种肿瘤的免疫细胞共性。未来研究应集中于以下几点:(1)进一步明确肿瘤浸润免疫细胞分化轨迹和表型;(2)鉴定不同免疫细胞亚群在不同肿瘤中的作用;(3)继续探索肿瘤浸润免疫细胞和免疫治疗的相关性。综上所述,scRNA-seq是解析肿瘤浸润免疫细胞的细胞和分子特征的强大工具,有望全面阐明肿瘤免疫微环境异质性并促进病人精准个体化治疗。

利益冲突 :所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献声明 :杜启联:研究选题设计、收集资料、论文撰写、论文修改,宋恩峰:研究选题设计、论文撰写、论文修改;胡钦勇:研究选题设计、论文撰写、论文修改、经费支持