茯苓酸调节PI3K/AKT/NF-κB信号通路对大鼠幽门螺旋杆菌相关性胃炎的治疗作用

徐 璐，张冬雨，王瑞锋

郑州大学附属儿童医院/河南省儿童医院郑州儿童医院 1.检验科 郑州市儿童感染与免疫重点实验室；2.消化科，河南 郑州 450000

幽门螺旋杆菌(Helicobacterpylori,Hp)是一种螺旋形革兰氏阴性细菌,通过口-口和粪-口途径传播和感染,几乎所有感染的患者都会发生不同程度的胃炎,它可以从急性/慢性炎性反应、肠化生、慢性萎缩性胃炎、不典型增生发展至上皮内瘤变,甚至是胃癌[1]。侵入性、内窥镜检查和非侵入性方法如呼吸、粪便和血清学检查用于诊断Hp感染,治疗上采用强酸抑制剂与抗生素或铋的组合,但需要考虑到个人病史和抗生素耐药性的急剧增加,治疗效果有限[2]。茯苓酸(pachymic acid, PA)是一种来自茯苓的羊毛脂三萜化合物,可抑制多种疾病中的炎性反应[3],但在胃炎中的研究较少。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)参与细胞增殖、分化、凋亡等多种细胞功能的调节,有文献指出,抑制PI3K及其下游因子蛋白激酶B(protein kinase B, AKT)、激活核因子(nuclear factor, NF)-κB信号可以调节多种炎性反应,抑制促炎因子的分泌,显著改善急性胃炎模型小鼠的胃黏膜炎性反应病变[4]。然而,PA能否通过调节PI3K/AKT/NF-κB信号通路影响Hp相关性胃炎尚不清楚。本研究旨在讨论PA对Hp相关性胃炎的影响及PI3K/AKT/NF-κB通路的调控作用,以期为Hp相关性胃炎的治疗提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物:SPF级7～8周龄SD雄性大鼠(200～230 g,北京药康生物科技有限公司[SCXK(京)-2023-0008]),饲养环境为12 h/12 h光暗循环,温度(23±1)℃,湿度(55±5)%。研究方案已通过伦理委员会批准,实验操作遵守相关规定。

1.1.2 试剂:PA(纯度≥98%,DF0001,德思特生物公司);740 Y-P(PI3K激动剂,HY-P0175,MCE公司);白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、IL-10、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosor-bent assay,ELISA)试剂盒(上海科艾博生物技术有限公司);一抗磷酸化-NF-κB p65(p-NF-κB p65)(ab239882)、NF-κB p65(ab19870)、p-PI3K(ab182651)、PI3K(ab302958)、p-AKT(ab38449)、AKT(ab8805)(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 实验分组:构建Hp相关性胃炎大鼠模型[5]:大鼠禁食12 h,灌胃NaHCO3+消炎镇痛药0.5 mL/只,禁食6 h,以含量为109CFU/mL的Hp菌液灌胃(1.5 mL/只),禁食禁水4 h后恢复常规饲养,隔天1次,持续10 d,恢复常规饲养。ELISA检测大鼠血清是否含有HpIgG抗体,有则代表造模成功。

将大鼠随机分为5组:对照组(CT组)、模型组(M组)、PA低剂量组(PA L组)、PA高剂量组(PA H组)、PA H+740 Y-P组,每组12只。除CT组以外大鼠建立Hp相关性胃炎模型,CT组大鼠灌胃0.9%氯化钠溶液。造模成功后大鼠常规饲养4周,PA L组、PA H组大鼠分别腹腔注射3.33、13.32 mg/kg剂量的PA[6];PA H+740 Y-P组大鼠腹腔注射PA 13.32 mg/kg+尾静脉注射740 Y-P 10 mg/kg[7];CT组和M组大鼠腹腔注射等量0.9%氯化钠溶液。1次/d,给药持续4周,造模和给药期间损失大鼠及时补充。

1.2.2 胃黏膜损伤指数(gastric mucosal damage index,UI)的评估:每组随机选6只大鼠,采用吸入乙醚法麻醉大鼠,仰位固定,快速取出胃组织,自胃大弯剪开胃部,使用生理盐水冲洗干净,棉签擦拭,观察胃黏膜水肿、充血及溃疡情况。根据GUTH法评价UI[8]:统计胃黏膜各病灶长度之和,≤1 mm记为1分;1 mm～≤2 mm记为2分;2 mm～≤3 mm记为3分;3 mm～≤4 mm记为4分;>4 mm记为5分;病灶宽度>2 mm则UI值加倍。检测完成的胃组织匀浆后,分装储存在-80 ℃冰箱。

1.2.3 电镜观察胃黏膜细胞:每组随机选6只大鼠,麻醉后取胃组织冲洗干净,一半胃组织固定于4%多聚甲醛中待测,另一半胃组织固定于电镜固定液中4 h,使用0.1 mol/L的缓冲液漂洗3次,在1%的锇酸中固定2 h,再次漂洗,依次使用50%、70%、80%、90%、95%、100%乙醇和100%丙酮上脱水;包埋机包埋,置入37 ℃烤箱过夜,切80 nm超薄片;切片使用铀铅双染色(2%醋酸铀饱和乙醇溶液和枸橼酸铅分别染色15 min),室温下干燥过夜,次日使用透射电子显微镜观察切片并采集图像。

1.2.4 HE染色观察胃黏膜病理学变化:将1.2.3固定于多聚甲醛的胃组织石蜡包埋,制作5 μm薄片,脱蜡,苏木精染色切片15 min,盐酸乙醇分化10 s,浸入弱碱性溶液中返蓝,再置于85%乙醇溶液中,伊红染色5 min,梯度脱水,封片,显微镜下观察病理学特征。

1.2.5 ELISA法检测胃组织炎性因子、氧化应激因子水平:取1.2.2中胃组织匀浆液,10 000 r/min离心20 min后,取上清,使用ELISA试剂盒检测上清中炎性因子IL-6、TNF-α、IL-10以及氧化应激因子iNOS、SOD的水平。

1.2.6 Western blot检测胃组织蛋白表达:取1.2.2中胃组织匀浆液,使用Western blot法检测其蛋白表达水平。再次匀浆样品,蛋白定量并等量点样在凝胶中,经电泳、转膜将样品条带在PVDF膜上按分子量大小分开,将PVDF膜分别孵育在p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、p-NF-κB p65、NF-κB p65抗体中,再经过二抗和ECL化学发光液反应,分析各蛋白的表达水平。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 各组大鼠UI比较

CT组大鼠胃黏膜无损伤情况;与CT组比较,M组大鼠胃黏膜上皮水肿、充血,溃疡严重,UI升高(P<0.05);与M组比较,PA L组、PA H组大鼠溃疡部位减少,水肿改善,UI呈剂量依赖性降低(P<0.05);与PA H组比较,PA H+740 Y-P组大鼠溃疡情况严重,上皮充血,UI升高(P<0.05)(表1)。

表1 各组大鼠胃黏膜损伤指数(UI)比较

2.2 各组大鼠胃黏膜形态学比较

CT组大鼠胃黏膜上皮细胞排列整齐,细胞膜完整,细胞器结构正常;M组大鼠胃黏膜上皮细胞固缩,细胞膜出现破裂,细胞器肿胀、游离、空泡变;与M组比较,PA L组、PA H组胃黏膜上皮细胞膜较完整,细胞器肿胀程度改善、结构较正常;与PA H组比较,PA H+740 Y-P组胃黏膜上皮细胞损伤较严重,细胞膜破裂(图1)。

图1 透射电镜观察胃黏膜形态学Fig 1 Morphology of gastric mucosa observed by transmission electron microscopy

2.3 各组大鼠胃黏膜病理形态学特征比较

CT组大鼠胃黏膜皱壁正常,未见充血和黏膜糜烂;M组大鼠胃黏膜变薄,黏膜糜烂,部分腺体轻微扩张,可见炎性细胞浸润;与M组比较,PA L组、PA H组胃黏膜皱壁趋于正常、糜烂改善、少许充血,少量炎性细胞浸润;与PA H组比较,PA H+740 Y-P组胃黏膜糜烂加重,炎性细胞浸润增加(图2)。

图2 HE染色检测胃黏膜病理形态学特征Fig 2 Pathologic characteristics of gastric mucosa detected by HE staining

2.4 各组大鼠胃组织IL-6、TNF-α、IL-10水平比较

与CT组比较,M组IL-6、TNF-α水平升高,IL-10水平下降(P<0.05);与M组比较,PA L组、PA H组IL-6、TNF-α水平下降,IL-10水平升高,且呈剂量依赖性(P<0.05);与PA H组比较,PA H+740 Y-P组IL-6、TNF-α水平升高,IL-10水平下降(P<0.05)(表2)。

表2 各组大鼠胃组织IL-6、TNF-α、IL-10水平比较Table 2 Comparison of IL-6, TNF-α and IL-10 levels in gastric tissue of rats in each pg/mL, n=6)

2.5 各组大鼠胃组织iNOS、SOD水平比较

与CT组比较,M组iNOS水平升高,SOD水平下降(P<0.05);与M组比较,PA L组、PA H组iNOS水平下降、SOD升高,且呈剂量依赖性(P<0.05);与PA H组比较,PA H+740 Y-P组iNOS水平升高、SOD水平下降(P<0.05)(表3)。

表3 各组大鼠胃组织iNOS、SOD水平比较

2.6 各组大鼠胃组织蛋白表达水平比较

与CT组比较,M组p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表达水平升高(P<0.05);与M组比较,PA L组、PA H组p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表达水平呈剂量依赖性下降(P<0.05);与PA H组比较,PA H+740 Y-P组p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表达水平升高(P<0.05)(图3)。

*P<0.05 compared with CT group; #P<0.05 compared with M group; △P<0.05 compared with PA L group; &P<0.05 compared with PA H group.

3 讨论

Hp拥有多种毒力基因,使细菌能够适应胃部的酸性环境,并附着在胃上皮细胞上,引起慢性炎性和组织损伤[11]。研究发现,患者感染Hp后IL-6和TNF-α水平升高,促炎因子IL-6可以诱导血管内皮生长因子的产生,而TNF-α具有促进癌细胞增殖、侵袭和转移以及肿瘤血管生成的潜力,因此Hp引起的胃炎也是胃癌发生的第一步[12]。Hp利用IL-10的免疫抑制作用来帮助其逃离宿主的免疫系统,进而诱导胃部慢性炎性反应[13]。本研究采用Hp菌液灌胃法建立Hp相关性胃炎大鼠模型,发现Hp相关性胃炎大鼠胃黏膜糜烂,上皮水肿、充血、溃疡和炎性细胞浸润严重,且胃组织中IL-6、TNF-α水平升高,IL-10水平下降,表明Hp持续感染促进促炎细胞因子的分泌,诱发组织损伤;PA有效改善模型大鼠胃黏膜糜烂,上皮水肿、溃疡及炎性细胞浸润情况,下调IL-6、TNF-α水平,上调IL-10水平,减轻胃黏膜损伤。此外,细菌分泌的毒力因子激活氧化应激也会介导宿主细胞的慢性炎性反应[14]。iNOS是机体活性氮自由基产生的催化酶,iNOS一旦被激活会持续较长时间并产生大量NO,刺激氧化应激并引起胃损伤;SOD保护机体免受自由基的损害,SOD水平的降低可能引发链状脂质过氧化,加剧胃黏膜细胞损伤[15]。在本研究中,模型大鼠胃组织iNOS水平升高、SOD水平下降,说明大量的NO和自由基可能加速胃炎的进展,这种变化可以被PA缓解,提示PA可改善Hp相关性胃炎大鼠胃组织中氧化-抗氧化之间的不平衡。

PI3K介导细胞炎性反应调节过程,PI3K的激活会促使AKT活化,进而激活NF-κB,诱导多种炎性相关基因的表达[16]。抑制PI3K/AKT/NF-κB通路的活化可减少氧化应激和炎性反应,对胃溃疡发挥保护作用[17]。本研究发现,胃炎大鼠胃组织p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白水平升高,PA能抑制胃炎大鼠PI3K/AKT/NF-κB信号的激活,且PI3K激活剂740 Y-P可减弱PA对胃炎大鼠的胃黏膜损伤的改善作用,提示PA可能通过抑制PI3K/AKT/NF-κB通路,减轻Hp相关性胃炎大鼠胃黏膜损伤。

综上所述,PA可能通过抑制PI3K/AKT/NF-κB通路发挥对Hp相关性胃炎大鼠的治疗作用。然而,Hp相关性胃炎的病因十分复杂,PA的作用机制还需更加广泛、深入的探究。