基于国产液相色谱串联质谱检测系统对血清中25-羟基维生素D含量检测的验证

姜瑞凤 刘传兴 宋文君 张曼玉 杲立博 牛天渭 青岛惠安康生物工程有限公司 （山东 青岛 266114）

内容提要：目的：基于国产高效液相色谱串联质谱检测系统HAK6000，建立了准确测量血清中25-羟基维生素D的液相色谱-串联质谱法。方法：通过对样本中的25-羟基维生素D2[25(OH)D2]、25-羟基维生素D3[25(OH)D3]进行沉淀蛋白、萃取、氮吹浓缩等步骤获取目标物及其内标的提取液，采用HAK6000直接对其中的目标物进行检测。另外，使用HAK6000、AB 4500MD两台不同厂家的串联质谱设备测定26例血清样本，进行相关性分析。结果：采用HAK6000对样本中的目标物25(OH)D2、25(OH)D3进行检测，分别在1.25～40ng/mL和5～160ng/mL范围内的线性相关系数R>0.9990，两者的检出限分别为0.4ng/mL、1.6ng/mL，定量限分别为1.25ng/mL、5.0ng/mL，质控品精密度优于5.0%。HAK6000、AB 4500MD串联质谱设备测定血清样本，2组数据的相关系数R≥0.99，这表明2台仪器所测结果一致。结论：HAK6000可以达到准确定量检测血清25-羟基维生素D的水平，能够满足临床诊断需求。HAK6000将为临床质谱分析提供一种更具性价比的选择，助力国产质谱仪发展。

维生素D主要组成成分为维生素D2及维生素D3，可以通过皮肤合成或食物摄取获得。维生素D缺乏不仅与骨质疏松症和软骨化症相关，而且容易导致肌肉力量下降[1]。近年来发现维生素D与心血管疾病、糖尿病、多发性硬化症等多种疾病都有相关性[2-4]。足量的体内维生素D水平与多发性硬化症、糖尿病等都有相关性，足量的体内维生素D水平对多发性硬化症、糖尿病等有一定预防作用。人体内维生素D主要以25-羟基维生素D的形式存在，约占维生素D总量的95%，且半衰期最长，性质稳定[5]。25-羟基维生素D的产生是由于维生素D在肝脏微粒体中经单氨酶系统作用，25位羟基化产生。分别测定25-羟基维生素D2[25(OH)D2]、25-羟基维生素D3[25(OH)D3]可以直接反映生物体内维生素D真实活性的水平，具有重要的临床意义和疗效判定意义。临床上常见的检测方法有化学发光法、免疫荧光层析法和液相色谱-串联质谱法（Liquid Chromatography-Massspectrometry/Mass Spectrometry，LC-MS/MS）等，其中，LC-MS/MS具有高准确度、高灵敏度和高特异性的特点，是国际公认的测定25(OH)D的“金标准”[6-13]。

本研究拟采用高效液相色谱串联质谱检测系统HAK6000测量血清中25(OH)D的含量。结合第二类医疗器械注册产品25-羟基维生素D检测试剂盒（液相色谱-串联质谱法），建立同位素稀释质谱定量分析方法，经方法确证后，开展批量临床样本定量分析研究，并与进口品牌AB SCIEX Triple Quad™4500MD的测量结果进行对比，以期验证国产质谱仪在临床检测方面的表现，为国产质谱仪技术和应用的快速发展提供帮助。

1.材料与方法

1.1 一般材料

研究起止时间：2023年4月～2023年5月。

样本：本研究共采集了26例人血清样本，血清样本均来自于人体静脉血，经离心后得到血清，每样品血清不少于500μL，保存于-70˚C冰箱中。仪器与试剂见表1。

表1.仪器与试剂

1.2 方法

通过对样本中的25-羟基维生素D2（25(OH)D2）、25-羟基维生素D3[25(OH)D3]进行沉淀蛋白、萃取、氮吹浓缩等步骤获取目标物及其内标的提取液，采用HAK6000直接对样本中的目标物进行检测。另外，使用HAK6000、AB 4500MD两台不同厂家的串联质谱设备测定26例血清样本，进行相关性分析。

1.2.1 试剂准备

检测前，所有试剂及样本应恢复至室温，并充分混匀。

校准曲线各梯度的配制：按照检测试剂盒说明书将校准品稀释得到25-羟基维生素D2浓度为1.25、2.5、5、10、20、40ng/mL和25-羟基维生素D3浓度为5、10、20、40、80、160ng/mL的标准系列溶液。

标记物释放液A的配制：取100µL内标液加入4mL释放液A中，混匀。

1.2.2 样本处理

取各标准系列溶液、质控品、血清样本各200µL分别加入2mL离心管，加入400µL前述含标记物释放液A，涡旋5s后，混匀振荡3min；加入1.20mL释放液B，颠倒混匀5次后，振荡3min；4˚C，10000r/min以上，离心5min，取上清液加入玻璃管中，各玻璃管38˚C以下氮气吹干；加入100µL复溶液至玻璃管，涡旋混匀5s，移入96孔板，上机检测。

1.3 检测条件

1.3.1 色谱条件

液相色谱柱常规柱型3.0mm×50mm，3µm；柱温：40˚C；流动相：A为含溶液A的水溶液，按1.5:500的比例在水中加入溶液A；B为含溶液B的甲醇溶液，按1.5:500的比例在甲醇中加入溶液B。流速：600µL/min。梯度洗脱：0.2min：流动相B为75%；0.8min：流动相B为98%；2.5min：流动相B为98%；2.51min：流动相B为75%；4.0min：流动相B为75%。

1.3.2 质谱条件

AB 4500MD质谱条件：电喷雾离子源，正离子模式，MRM扫描分析，电喷雾电压5500V，离子源温度500˚C，GS1 50，GS2 50，Curtain Gas 20。其他质谱参数见表2。

表2.AB4500MD质谱参数

HAK6000质谱条件：电喷雾离子源，正离子模式，多反应监测模式，毛细管高压5kⅤ，去溶剂气450˚C，雾化气1.6L/min，去溶剂气5L/min，挡板电压550V，反吹气1.2L/min，碰撞气0.55mL/min。其他质谱参数见表3。

表3.HAK6000质谱参数

2.结果与讨论

2.1 方法确证

2.1.1 线性关系

记录色谱图中检测样目标物峰面积与内标峰面积，并计算目标物和其内标峰面积的比值，通过对标准物质各标示浓度（x）、目标物峰面积与内标峰面积比值（y）绘制标准曲线并拟合标准曲线方程，25(OH)D2和25(OH)D3：线性范围分别为1.25～40ng/mL和5～160ng/mL，线性方程相关系数R≥0.9990，见图1。

图1.标准曲线

2.1.2 精密度

精密度由变异系数（Coefficient of Ⅴariation，CV）表示。对低、高值质控样品重复测定10次，连续测定3d，日内和日间精密度结果列于表4。结果表明，所有测量结果均在靶值范围内并接近目标值，其中25(OH)D2和25(OH)D3的日内和日间精密度范围分别为1.32%～4.11%和2.15%～4.19%。

表4.方法确证结果

2.1.3 准确度

准确度用相对偏差表示。采用有证参考物质[GBW(E)090965]，进行3次重复测试，计算相对偏差（B），且满足重复测定3次相对偏差（B）均在±15%范围内，结果列于表4。可见，25(OH)D2的相对偏差分别为3.18%、4.51%和3.74%；25(OH)D3的相对偏差分别为2.51%、3.69%和4.46%，测量过程可以保证检测结果的准确性。

2.1.4 检出限和定量限

以3 倍信噪比(S/N)作为检出限，10 倍信噪比作为定量限，且满足重复测定5 次峰面积CV ≤15%，结果列于表4。25(OH)D2和25(OH)D3的检出限可以满足0.4ng/mL、1.6ng/mL，定量限可以满足1.25ng/mL、5.0ng/mL。

2.2 方法验证

使用低、高值质控品对所建立的方法进行验证，结果见表5。2台设备检测的结果一致，均在靶值范围内，说明所建立的方法准确、可靠。

表5.质控品检测结果

2.3 样本检测

分别采用HAK6000和AB 4500MD 2台液相色谱串联质谱检测系统测定26例经处理后的血清样品，样本检测结果见图2。

图2.样本检测结果

分析研究数据的相关性，绘制散点图，结果见图3。

图3.检测结果相关性分析

可见，HAK6000和AB 4500MD之间的相关系数R>0.99，说明两者之间存在显著的正相关，表明这2台仪器所测的结果一致。

3.结论

近几年，因国际环境的变化和国家政策的支持，以及医疗卫生领域对精准医疗的普及，国产质谱设备如雨后春笋般涌现出来，其性能参数也在不断提高。作为已经取得国家医疗器械第二类注册证的国产高效液相色谱串联质谱检测系统HAK6000来说，不但填补了国产高端仪器的空白，还能为客户提供更具性价比的选择。通过本研究证明，HAK6000可以满足对血清中25-羟基维生素D浓度检测的要求，也希望其能在更多的临床检测项目中发挥更大的作用。