脂肪酶催化制备长短链甘油三酯的工艺研究

叶双 王宏雁

本研究借鉴前人研究，在无溶剂介质中通过脂肪酶催化大豆油和丁酸乙酯酯交换反应，以丁酸插入率为指标，探究合成长短链甘油三酯的最佳反应条件，丰富了国内对大豆油改性制备低热量结构脂质的全面研究。

一、材料与仪器

1.材料。大豆油，浙江益海嘉里食品工业有限公司；丁酸乙酯（纯度＞98%），天津市科密欧化学试剂有限公司；固体脂肪酶Novozyme 435，诺维信生物技术有限公司；丁酸甲酯，上海Merck公司；正己烷及其他有机试剂均为国产分析纯或色谱纯。

2.仪器。SHA-C数显水浴恒温振荡器，常州丹瑞实验仪器设备有限公司；气相色谱仪，美国安捷伦公司；BS224S电子天平，赛多利斯科学仪器有限公司；离心机，常州国华电器有限公司。

二、实验与方法

1.长短链脂肪酸甘油三酯的制备与分离。（1）制备。大豆油与丁酸乙酯的酯交换反应在无溶剂体系中进行。称取15g大豆油与一定量的丁酸乙酯置于150mL锥形瓶内，混合均匀后加入一定量的固定化脂肪酶Novozyme 435，盖紧塞子，将其放在恒温水浴振荡器中，保持100r/min的振荡速率，在特定温度下反应4h后终止，过滤除去固体脂肪酶。（2）薄层层析法分离。选用100mm×200mm规格的硅胶板，对丁酸乙酯、大豆油和酶催化大豆油与丁酸乙酯合成的长短链甘油三酯产物进行TLC分析，参照标准谱图将对应的长短链甘油三酯条带刮下，用正己烷萃取2次，加入适量的无水硫酸钠，然后旋蒸除去正己烷。

2.产物组成分析。采用气相色谱检测方法对产物组成进行分析。称取0.1g样品，溶于10mL正己烷中，混合均匀后取1mL置于色谱瓶中进行气相分析。

气相色谱条件如下：色谱柱DB-1HT毛细血管（29m×250μm×0.2μm）；载气N2（纯度99.999%）；进样量1，进样口温度260℃，分流比20：1；氢火焰离子化检测器，检测口温度380℃；氢气流量60mL/min，空气流量400L/min，尾吹气流量50mL/min。程序升温条件如下：温度80℃，保持2min；以10℃/min的升溫速率持续加热至200℃，保持1min；以30℃/min的升温速率加热至350℃，保持6min。

3.脂肪酸组成分析。采用甲酯化方法对脂肪酸组成进行分析。称取100mg分离后的产物，加入0.2mol/L的氢氧化钠-甲醇溶液2mL，快速混匀，再移取3mL的正己烷震荡30s，使之充分混合后，放入离心机离心2min，获得分层溶液，将上层透明澄清溶液用无水硫酸钠干燥，然后吸取上清液用于气相分析。

气相色谱分析条件如下：BPX70，30m×0.25mm×0.25μm；载气N2；进样量1；检测器温度250℃，进样口温度250℃；氮气流速32mL/min，氢气流速50mL/min，空气流速400mL/min。程序升温条件如下：温度60℃，保持3min；以10℃/min的升温速率持续加热至180℃；以5℃/min的升温速率加热至230℃，保持3min。

4.丁酸插入率的测定。丁酸插入率的计算公式如下：

三、结果与讨论

1.产物组成分析。图1为产物甲酯化后的气相色谱图。对照各标准样品对产物谱图进行定性分析，丁酸甲酯的保留时间为2.119min，棕榈酸甲酯的保留时间为15.176min，硬脂酸甲酯的保留时间为16.642min，油酸甲酯的保留时间为16.905min，亚油酸甲酯的保留时间为17.383min，亚麻酸甲酯的保留时间为17.887min。由图1可以看出，在本实验选定的反应条件下，图中未出现太多杂峰，且各脂肪酸甲酯的分离情况较好。

图1：产物甲酯化气相色谱图

2.单因素实验结果分析。（1）反应时间对长短链甘油三酯含量的影响。在丁酸乙酯与大豆油的摩尔比为3：1、反应温度为50℃、加酶量为总底物的9%时，每次间隔2h进行一次产物取样，以探究制备长短链甘油三酯的最佳反应时间，探究结果如图2所示。

图2：反应时间对丁酸插入率的影响

由图2可知，在不同反应时间下进行长短链甘油三酯的制备，丁酸插入率发生了改变。在开始反应的10h内，随着时间的推移，反应速度加快，丁酸插入率持续提升，在反应了10h时，丁酸的插入率达到12.16%；而在反应了10h之后，丁酸插入率反而下降。这是因为酯交换反应是一个对峙反应，也可以用化学动力学平衡理论对这种现象进行解释。在反应早期，正向反应的速率快于反向反应的速率，因此丁酸插入率会不断增加。随着反应的进行，反向反应的速率逐渐增加，正向反应的速率逐渐降低，最终达到动态平衡，这时反应的产物和反应物浓度不再发生变化，所以插入率也不再增加。随着时间的推移，由于反向反应速率增加，丁酸插入率反而会下降。综合考虑，反应进行10h为最佳，所以本实验在后续阶段会把反应10h时的数据作为主要数据。

（2）加酶量对长短链甘油三酯含量的影响。在反应时间为10h、丁酸乙酯与大豆油的摩尔比为3：1、反应温度为50℃的反应条件下，探究不同反应温度对制备长短链甘油三酯的影响，探究结果如图3所示。

图3：加酶量对丁酸插入率的影响

由图3可知，在加酶量为3%-9%时，丁酸插入率随着加酶量的增加而增加，但在加酶量超过9%后，丁酸插入率反而随着加酶量的提升而降低。在反应初期，较高的加酶量会促进酶活性位点提高反应速率，导致酰基供体的掺入量增加。同时在这一时期，底物分子与酶分子的结合比较容易，酶底物复合物的形成速率较快，使得丁酸插入率随着加酶量的增加而提升。但当加酶量超过一定阈值时，丁酸插入率反而会随着加酶量的增加而降低，这是因为随着反应的进行，脂肪酶产生聚集，致使底物难以扩散，从而导致反应速率下降。为了降低生产成本并提高反应效率，加酶量控制在9%为最佳。

（3）反应温度对长短链甘油三酯含量的影响。在反应时间为10h、丁酸乙酯与大豆油的摩尔比为3：1、加酶量为总底物的9%时，探究不同反应温度对制备长短链甘油三酯的影响，探究结果如图4所示。

图4：反应温度对丁酸插入率的影响

由图4可知，在反应温度为40℃-60℃時，丁酸插入率显著提升。根据Arrhenius定律，反应温度的升高通常导致由酶催化的加速效应，由于热力学平衡的移动，高温有利于反应正向移动，较高的温度也降低了溶液的粘度，减少了传质限制，此时底物分子与酶分子之间的相互作用增强，酶与底物的结合力增加，使得酶底物复合物的形成速率提高。但当反应温度超过一定阈值时，酶会发生构象变化，酶分子的空间构型发生改变，酶的催化活性会受到影响；同时，温度升高也会加速酶的失活，降低酶的稳定性，使酶分子失去原有的催化能力，从而导致丁酸插入率开始降低。

（4）丁酸乙酯与大豆油的摩尔比对长短链甘油三酯含量的影响。在反应时间为10h、反应温度为60℃、加酶量为总底物的9%的反应条件下，探究丁酸乙酯与大豆油的不同摩尔比对制备长短链甘油三酯的影响，探究结果如图5所示。

图5：丁酸乙酯与大豆油的摩尔比对丁酸插入率的影响

酯交换反应是一个可逆反应，反应平衡是一个动态过程，这种平衡仅与起始反应物的浓度相关，即丁酸乙酯与大豆油的摩尔比。由图5可知，在丁酸乙酯与大豆油的摩尔比在1：1-3：1时，随着底物中丁酸的量不断上升，丁酸插入率显著提升；但是在丁酸乙酯与大豆油的摩尔比达到3：1之后，丁酸插入率转为下降。这是因为在丁酸乙酯与大豆油的摩尔比在1：1-3：1时，丁酸量的增加可以提高丁酸在化学反应中的浓度，从而促进丁酸的插入率；但当丁酸乙酯与大豆油的摩尔比超过3：1时，丁酸乙酯的浓度占据了主导地位，丁酸的浓度相对降低，从而导致丁酸插入率下降。综合考虑，选择丁酸乙酯与大豆油的摩尔比为3：1最合适。

综上所述，本研究以丁酸乙酯和大豆油为原料，固体脂肪酶Novozyme 435为催化剂，探究了反应时间、反应温度、加酶量和底物比率对大豆油中丁酸插入率的影响。结果表明，在反应时间为10h、反应温度为50℃、加酶量为9%、丁酸乙酯与大豆油的摩尔比为3：1时，大豆油中的丁酸插入率最高。

作者简介：叶双（1999-），女，汉族，河南南阳人，硕士研究生在读，研究方向为油脂化工。

*通信作者：王宏雁（1963-），男，汉族，河南郑州人，副教授，硕士研究生，研究方向为应用化学。