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辣椒CaPI 的克隆与功能分析

2024-04-17吴星星洪海波甘志承李瑞宁黄先忠

生物技术通报 2024年3期
关键词:分枝拟南芥转基因

吴星星 洪海波 甘志承 李瑞宁 黄先忠

(安徽科技学院农学院 作物生物技术研究中心,滁州 233100)

在真核生物中,MCM1‑AGAMOUS‑DEFICIENS‑SRF(MADS‑box)是植物生理和发育过程中的一类转录因子[1],具有保守性很强的DNA 结合结构域[2]。MADS‑box 不仅在植物生殖发育各个方面起着关键性调控,而且在控制开花时间、花序结构、花器官身份确定和种子发育中具有重要作用[3]。开花是建立作物产量的一个脆弱但关键的阶段,适时适机开花不仅影响株型结构,对获得最佳产量至关重要,开花生物学机制研究一直是重要的研究课题。

MADS‑box 包 括I 型 和II 型 两 种 类 型,II 型MADS‑box 主 要 参 与 花 器 官 发 育[4]。PISTILLATA(PI)既属于典型Type II 型MADS‑box 基因亚家族中的一类,也是ABC(D)E 模型中的B 类基因[5]。Coen 等[6]最早提出花发育ABC 模型,后来又发展出ABCDE 模型[2],其中,A 类基因是形成萼片所必需的,A+B+E 类基因决定花瓣的发育,B+C+E类基因决定雄蕊的发育,C+E 类基因决定心皮的形成,D 类基因与胚珠发育有密切联系,而E 类基因在所有过程中都起作用[7-9]。在模式植物拟南芥中,APETALA1(AP1)是典型的A 类基因;而属于B类基因的是AP3 和PI;AGAMOUS(AG)是一种具有C 类功能的代表性基因;SEPALATA(SEP)则属于E 类基因;D 类基因包括SEEDSTICK(STK)和SHATTERPROOF1(SHP1)[10]。PI 是调控植物花器官发育的B 类基因,是花瓣和雄蕊形成的关键因子。高表达的拟南芥PI,通过控制AP1 的表达来控制花的发育[11-12]。不同植物中,PI 功能并不完全保守,而是具有一定差异[13]。在漫长的演化过程中,植物PI 同源基因在经历了多次基因复增事件后,产生了许多亚功能化或者新功能化的基因,对于调控植物花器官多样性具有重大意义[14]。

辣椒(Capsicum annuum L.)为茄科(Solanaceae)辣椒属(Capsicum)一年或有限多年生草本植物,为重要的经济和香料作物,在我国南北均有大量传播和种植[15]。由于辣椒独特的风味和辣椒素,使辣椒在全世界食品和医药上不可缺少[16]。辣椒是雌雄同株自花授粉植物,其产量性状与辣椒开花时间和开花数量息息相关[17]。在拟南芥(Arabidopsis thaliana)[18]、人参(Panax ginsengy)[19]、萼脊兰(Sedirea japonica)[20]、 大 蒜(Allium sativum)[21]、墨 兰(Cymbidium sinense)[22]、 牡 丹(Paeonia suffruticosa)[23]等植物中的PI 克隆和功能分析都有报道,但关于辣椒PI 同源基因的序列、表达特征和功能未见报道。Gan 等[24]对辣椒MADS‑box 基因家族的全基因组鉴定、进化及表达特征进行了分析,鉴定了一个辣椒PI 同源基因,但未见功能报道。

本研究利用RT‑PCR 技术从一年生辣椒中克隆CaPI;利用生物信息学的方法分析序列特征,分析辣椒CaPI 蛋白理化性质和预测蛋白二级三级结构;利用实时荧光定量PCR(RT‑qPCR)分析CaPI 基因在不同组织和不同花器官组织的表达特征;通过构建35S:CaPI 过表达载体对拟南芥进行遗传转化,对转基因拟南芥进行表型分析,从而初步探索CaPI 基因功能。本研究为将来深入探索辣椒PI‑like 同源基因的功能及其分子机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

材料为一年生辣椒(Capsicum annuum)自交系(编号G7),由安徽科技学院辣椒遗传育种团队提供,无限生长型、花单生、花期适中。将辣椒播种在育苗盘中育苗,然后移栽至温室(白天25℃ 16 h/黑夜18℃ 8 h,湿度60%)。采集生长6 周龄植株的根、茎、叶组织和生长3 个月盛开的花器官组织,包括雌雄蕊、花瓣、花萼及长度3 cm 的果实,液氮速冻后,‑80℃保存,3 次生物学重复。

1.2 方法

1.2.1 系统进化树构建 从TAIR(https://www.arabidopsis.org/)下载拟南芥AtPI(AT5G20240)蛋白序列,与已鉴定的辣椒MADS‑box 基因家族进行BLAST 比对[24],鉴定出CaPI‑like 基因(CaMADS61,Caz06g18830.1)。从辣椒数据库(http://ted.bti.cornell.edu/cgi‑bin/pepper/index)下 载CaPI 蛋 白 序 列。从Ensembl Plants(http://plants.ensembl.org/index.html)下 载 茄 子(Solanum melongena)、 番 茄(Solanum lycopersicum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、矮牵牛(Calibrachoa)、水稻(Oryza sativa)、小麦(Triticum aestivum)等植物的PI‑like 蛋白序列。利用MEAG 11 软件中的Clustal W[25]功能进行同源蛋白多重序列比对,利用MEGA 11 的Neighbor‑joining 功能构建系统进化树,参数均为默认[26]。

1.2.2 CaPI 蛋白理化性质分析 使用ProtParam 在线网站(https://web.expasy.org/protparam/)分析CaPI蛋白质的理化性质,用ProtScale(http://web.expasy.org/protscale/)在线网站进行蛋白质的疏水性行分析;利用NetPhos(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos)对PI 蛋白进行磷酸化位点预测;利用SOPMA(https://npsa‑prabi.ibcp.fr/cgi‑bin/npsa_automat.pl?page=npsa%20_sopma.html)对蛋白二级结构进行预测;使用Phyre2 在线网站(http://psort.hgc.jp/)分析蛋白质的三级结构。

1.2.3 辣椒总RNA 提取和cDNA 第一链的合成 使用TRIzol(Invitrogen, 美国)试剂,参照牛西强等[27]方法提取辣椒不同组织的总RNA。经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测RNA 质量,利用Nano Drop 2000 超微量分光光度计检测RNA 浓度与质量。使用MonScriptTMRTIII AII‑in‑One Mix with dsDNase(Monad,武汉)试剂盒合成cDNA 第一链。

1.2.4 RT‑qPCR 根据辣椒CaPI 编码区(CDS)序列设计RT‑qPCR 引物(表1),以CaUBI3 作为内参基因[28],反应体系为5 μL 2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(Vazyme,南京)、0.5 μL 上下游引物、1 μL cDNA,ddH2O 补至10 μL。反应程序为95℃ 30 s;95℃ 10 s,60℃ 30 s,40 个循环,溶解曲线95℃ 15 s;60℃ 60 s,95℃ 15 s,设置3个生物学重复。采用2-ΔCT计算[29]基因的相对表达量。利用Excel 2019 软件计算基因相对表达水平,使用Graph Pad Prism 8.0 软件作图和进行统计学分析。

表1 本研究使用到的引物Table 1 Primer information used in this study

1.2.5 CaPI 的克隆及过表达载体的构建 采用RT‑PCR 的方法克隆CaPI 的开放阅读框序列,反应体系为10 μL 2×Phanta Max Master Mix、0.5 μL 上下游引物、2 μL 花组织cDNA,ddH2O 补至20 μL。反应程序为95℃ 3 min;95℃ 15 s,56℃ 15 s,72℃ 15 s,35 个循环;72℃ 10 min。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测,回收目的片段,与pEASY 载体连接,转化大肠杆菌DH5α,37℃过夜培养。提取阳性克隆的质粒,酶切鉴定,送南京通用生物有限公司滁州分公司测序。

测序正确的pEASY‑CaPI 质粒,经Kpn I 和Xba I限制性内切酶酶切后,与pCAMBIA2300‑35S 载体连接,构建35S:CaPI 植物过量表达载体,转化至农杆菌GV3101 感受态,用于拟南芥遗传转化。

1.2.6 拟南芥的遗传转化及表型分析 将野生型拟南芥(Col‑0)种子用75%乙醇表面消毒10 min,无水乙醇清洗3 min。均匀撒播在1/2 MS 培养基中,4℃黑暗处理3 d,转至22℃光照培养箱(16 h 光照/8 h 黑暗)培养。生长7 d 后,将拟南芥幼苗移栽到含有蛭石∶营养土(体积比1∶1)的盆钵中,长日照(16 h 光照/8 h 黑暗)光照培养间培养,待生长至开花前期,采用floral‑dipping[30]方法将含有35S:CaPI农杆菌GV3101 菌液侵染到Col‑0 花苞上,在整个花期重复3 次侵染,待植株成熟后收获T0拟南芥种子。经卡那霉素和PCR 筛选,获得35S:CaPI 转基因拟南芥植株,经多代繁殖后,获得纯合转基因植株。待植株开花时,统计不同时期的野生型拟南芥和转基因拟南芥植株的莲座叶数、分枝数和开花天数,使用Graph Pad Prism 8.0 软件作图并进行统计学分析。收集开花时野生型和转基因拟南芥植株的莲座叶,提取RNA 并反转录成cDNA,利用RT‑qPCR 分析该基因在植株中的表达量。

2 结果

2.1 CaPI蛋白的理化性质

CaPI 蛋白的分子式为C1075H1755N329O333S16,由215 个氨基酸组成,分子质量为25.13 kD,等电点为8.74,脂肪系数为74.42,不稳定蛋白系数为61.02。CaPI 蛋白亲水性指数为‑0.894,预测为亲水蛋白。在线预测结果表明,CaPI 蛋白没有跨膜结构,亚细胞定位在细胞核。一级结构表明谷氨酸(Glu 10.7%)、赖氨酸(Lys 8.4%)、亮氨酸(Leu, 7.9%)、精氨酸(Arg 7.9%)、丝氨酸(Ser 7.0%)的含量较多,而色氨酸(Trp 0.5%)、苯丙氨酸(Phe 0.9%)、半胱氨酸(Cys 0.9%)含量较少。带正电荷的氨基酸(Arg+Lys)有35 个,带负电荷的氨基酸(Asp+Glu)有32 个。磷酸化分析结果(图1)显示,该氨基酸序列中Ser 位点可能有15 个被磷酸化,Thr 位点5个被磷酸化,Tyr 位点7 个被磷酸化。

图1 辣椒CaPI 蛋白磷酸化位点分析Fig.1 Analysis of phosphorylation sites of CaPI protein in C.annuum L.

2.2 CaPI蛋白的二级结构和三级结构分析

通过SOPMA 预测CaPI 二级结构,主要由α 螺旋组成(图2‑A),有128 个α-螺旋(59.53%)、26个延伸链(12.09%)、48 个无规则卷曲(22.33%)及13 个β-转角(6.05%)。进一步使用Phyre2 预测CaPI 三级结构(图2‑B),表明具有丰富的α 螺旋,与二级结构预测结果一致。此外,辣椒CaPI 与拟南芥AtPI 蛋白三级结构比较,都具有相同的α 螺旋。

图2 CaPI 蛋白结构分析Fig.2 Structural analysis of CaPI protein

2.3 不同物种PI基因系统进化树分析

为了研究辣椒CaPI 基因与其他植物中PI 基因的进化关系,进一步利用辣椒、茄子、番茄、马铃薯、矮牵牛、拟南芥、水稻、小麦中的17 个PI‑like 蛋白的氨基酸序列进行比对和系统进化树分析。结果(图3)发现,所有蛋白质都具有N 端“MGRGKIEIKRIEN”的氨基酸保守基序,说明PI 蛋白在其他物种中都具有较高的保守性[31]。系统进化树分析表明(图4),同为茄科作物的马铃薯(PGSC0003DMG401007392)、番茄(Solyc06g0557.4.1)和矮牵牛(Peaxi162Scf00 91g00074.1)的PI 蛋白与CaPI 蛋白相似性较高;与水稻和小麦的PI 蛋白进化关系较远。

图3 植物PI 类蛋白氨基酸序列多重序列比对Fig.3 Multiple amino-acid sequence alignments of the plant PI-like proteins

图4 辣椒CaPI 蛋白和其他植物的系统进化树Fig.4 Phylogenetic tree of the CaPI proteins in C.annuum L.and other plant species

2.4 CaPI在辣椒不同组织中的表达分析

运用RT‑qPCR 分析CaPI 在根、茎、叶、花、果实,以及花萼、花瓣、雄蕊、雌蕊中的表达情况。CaPI在辣椒花中高表达,但在其他组织中均不表达(图5‑A);CaPI 在花萼中表达量最高,其次是花瓣,在雄蕊中有较高的表达,但在雌蕊中几乎不表达(图5‑B)。暗示CaPI 在辣椒花器官的发育中起着重要的功能。

图5 RT-qPCR 分析CaPI 的组织表达特征Fig.5 Tissue expression pattern of the CaPI gene using RT-qPCR

2.5 拟南芥中过量表达CaPI的功能分析

为了探索CaPI 的功能,克隆CaPI 的648 bp 的ORF,测序证实基因ORF 长648 bp,编码215 个氨基酸。进一步构建植物过量表达载体35S:CaPI,利用浸花法转化到拟南芥Col‑0 中,经基因组扩增及RT‑qPCR 鉴定证实获得纯合的转基因植株。

当野生型和转基因植株开花时进行莲座叶数、开花天数、分枝数等表型统计(图6‑A)。结果发现,长日照条件下,35S:CaPI 转基因植株同Col‑0 的莲座叶数目(图6‑B)和开花时间(图6‑C)没有差异,表明过量表达CaPI 不影响开花时间。但35S:CaPI转基因植株的分枝数量明显均多于Col‑0,并且#2中的分枝数量明显多于#1(图6‑A, D)。RT‑qPCR分析也证实CaPI 在转基因株系#1 和#2 中高表达,并且在#2 中的表达量明显高于#1(图6‑E),表明分枝数量与表达量正相关,说明该基因在分枝发育过程中起十分重要的作用。此外,花的形态比较(图7)发现,与野生型(Col‑0)对照相比,35S:CaPI转基因拟南芥植株并未发生变化,说明CaPI 在拟南芥中过量表达不影响其花部组织的形态结构。

图6 35S:CaPI 转基因拟南芥的表型分析Fig.6 Phenotype survey of the 35S:CaPI transgenic plants in Arabidopsis thaliana

图7 拟南芥野生型(Col-0)与35S:CaPI 转基因植株花形态对比Fig.7 Comparison of flower morphologies between the wild-type(Col-0)and 35S:CaPI transgenic Arabidopsis plants

3 讨论

MADS‑box 作为植物最大转录因子家族之一,名称来自酿酒酵母转录因子MCM1、拟南芥花同源异型基因AGAMOUS、金鱼草花同源异型基因DEFICIENS 和人血清应答因子SRF 这4 种蛋白的首字母[2,30]。目前,43%-81%驯化基因由转录因子编码[3],MADS‑box 是调控植物生长发育最重要的转录因子之一,从种子发芽、营养发育到花器官发育阶段都起着重要作用[32]。PI 基因作为II 型MADS‑box 家族中的一员,与A 类和C 类基因共同调控花瓣和雄蕊的形成,其中,包括GLOBOSA(GLO)、DEFICIENS(DEF)、AP3 等花发育调控基因,并在拟南芥中证明PI 与AP3 基因相互正调控[33]。最早在水稻中鉴定出两类PI 基因OsMADS2 和OsMADS4,其中OsMADS2 表达随着花的成熟而快速增加,而OsMADS4 的表达从花发育早期就处于较高的水平[34-35]。 玉 米 中 已 鉴 定 出Zmm16、Zmm18 和Zmm29,其中Zmm16 在营养器官中微弱表达[36]。

本研究从一年生辣椒花器官中克隆PI 全长cDNA 序列,命名为CaPI。CaPI 有完整的开放阅读框,编码215 个氨基酸。CaPI 蛋白与多种植物类PI 蛋白序列有较高的相似度,其中,与矮牵牛相似度最高达99.54%。PI 基因所编码的蛋白质在不同物种中相对保守,都具有N 端“MGRGKIEIKRIEN”的氨基酸保守基序,因此,不同物种之间PI 同源基因具有相似的功能。系统进化树表明CaPI 与马铃薯分为一支,该分支与同为茄科植物形成的分支较为接近,与单子叶植物水稻分支最远,说明CaPI 与马铃薯PI 基因亲缘关系最近。通过对CaPI 理化性质和蛋白结构进行分析发现,CaPI 属于不稳定蛋白,并预测为亲水蛋白且没有跨膜结构;一级结构和磷酸化分析表明,CaPI 蛋白可能被丝氨酸蛋白激酶、苏氨酸蛋白激酶和酪氨酸蛋白激酶进行磷酸化修饰而被激活,从而调控二级响应基因的表达;二级结构分析发现,CaPI 主要以α-螺旋为主,这与其他MADS‑box 基因相同[37];三级结构显示CaPI 属于异质二聚体蛋白,暗示其与其他蛋白互作形成二聚体发挥功能,这一点在拟南芥中已有研究[38]。

CaPI 在辣椒不同组织表达特征存在差异,PI 同源基因在芸薹属油菜(Brassica napus)早期和晚期花蕾中表达差异明显[39];在甜瓜中,PI 基因通过调节下游靶基因的转录调控花性别发育,促进雄蕊的发育[40]。本研究中,CaPI 主要在花组织中特异表达,其中在花萼、花瓣、雄蕊中表达量最高,暗示CaPI在花器官的形成中起着十分重要的作用。为了研究CaPI 的功能,通过构建35S:CaPI 过表达载体,在野生型拟南芥(Col‑0)中异源表达验证其功能。结果显示,长日照条件下转基因植株同Col‑0 相比表现出分枝数增多,但莲座叶数目和开花时间与Col‑0 相比并没有明显差异,说明CaPI 过量表达不影响开花时间;进一步分子水平检测发现,转基因植株CaPI的表达量相比Col‑0 显著上调,并且在#2 中的表达量明显高于#1,暗示分枝数量与表达量正相关,说明CaPI 在分枝发育过程中起重要作用。对于这一结果推测是由于CaPI 的异源表达,使拟南芥某些分枝发育相关基因的表达发生变化,从而影响了分枝发育的调控网络。有研究表明PI 基因不仅在花中发挥作用,也有可能在枝条和叶片发育中发挥作用[41],但在辣椒中CaPI 调控分枝发育使分枝增多的分子机制、CaPI 转录因子的靶蛋白目前还未知。

总之,本研究从蛋白结构、氨基酸序列和系统进化分析,都表明CaPI 蛋白与其他物种中的蛋白序列较为相似。基因组织表达,证明CaPI 符合II 型MADS‑box 基因的表达情况。拟南芥中过量表达的结果表明CaPI 具有促进分枝的功能。综上所述,本研究为进一步深入研究CaPI 调控辣椒分枝发育的功能及其分子机制奠定了基础,为辣椒的分子育种提供基因元件,丰富茄科植物PI 类基因功能机制。

4 结论

从一年生辣椒中克隆获得CaPI 基因,ORF 长648 bp,编码215 个氨基酸。CaPI 在花中的表达量最高,其中,在花萼、花瓣和雄蕊中有高表达。过量表达CaPI 拟南芥侧枝增多,CaPI 能够促进分枝发育。

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