板蓝根配方颗粒喷雾干燥工艺优化研究＊

张兰兰，施文婷，陈伟媚，杨 赞，黄醒鹏，田清清，张 正

（广东一方制药有限公司广东省中药配方颗粒企业重点实验室 佛山 528244）

板蓝根药用部位为干燥根，取自十字花科植物菘蓝（拉丁名为Isatis indigoticaFort.），具苦寒之性，有清热解毒、凉血利咽的功效，可用于瘟疫时毒、发热咽痛等病症[1]。现代药理学研究发现，板蓝根具有丰富的药理作用，包括抗菌、抗病毒、抗内毒素和增强机体免疫调节等[2]，具有重要的临床价值。板蓝根主要化学成分有核苷类、木脂素类和生物碱类[3-4]，其中生物碱类是其抗病毒作用的关键成分，核苷类可干扰病毒核酸的合成达到抗病毒效果[5-6]。板蓝根配方颗粒是由板蓝根饮片经现代工艺加工而成，陈诺[7]利用薄层色谱法和高效液相色谱法验证了板蓝根配方颗粒及其饮片在化学成分上的一致性及等效性，早年亦有学者研究了不同干燥方式对板蓝根水提物有效成分的影响，证明了喷雾干燥的优势[8-10]，但尚未出现有关板蓝根配方颗粒喷雾干燥工艺的系统研究报道。

中药制剂工艺包括提取、分离纯化、干燥、制剂成型等环节，各工艺单元对中间体及制剂成品的质量均会产生不同程度的影响。因此，本文基于质量源于设计（Quality by design，QbD）理念对板蓝根配方颗粒成型过程中的喷雾干燥工艺进行研究，结合信息熵赋值法，以得粉率、尿苷含量、腺苷含量、鸟苷含量和(R,S)-告依春含量的综合评分作为评价指标[11]，通过Plackett-Burman 试验设计（PBD）筛选关键工艺参数，再通过中心点复合设计（Center Point Composite design，CCD）优化关键工艺参数，建立板蓝根配方颗粒喷雾干燥工艺的数学模型和设计空间，最后进行工艺验证[12]，以期为板蓝根配方颗粒的生产过程质量控制提供实验依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

本研究所用仪器详见表1。

表1 研究所用仪器

1.2 试药

本研究所用试药详见表2，其中板蓝根药材经广东一方制药有限公司孙冬梅主任中药师鉴定正品，同时经质量部门检验合格，可供本研究使用。

表2 研究所用试药

2 方法与结果

2.1 板蓝根清膏的制备

按照2020 版《中国药典》一部板蓝根项下饮片炮制方法[1]，将板蓝根药材制成板蓝根饮片，再依据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》的相关规定[13]，确定板蓝根浸膏的制备方法为：取板蓝根饮片1.6 kg，第1 次加饮片量8 倍水，加热煎煮30 min，第2 次加饮片量6 倍水，加热煎煮30 min，提取液均趁热用350 目筛网滤过，减压浓缩（70℃，-0.1 MPa）至相对密度为1.12（70℃）的清膏样品，保存备用。

2.2 喷干粉得粉率计算

每组试验取板蓝根清膏适量，控制每组试验所用清膏含固量约为30 g，置于磁力搅拌器上，按各试验组要求调节所需工艺参数进行喷雾干燥，喷雾干燥结束后，在相对湿度为40%以下的环境中收集喷干粉，计算每组试验得粉率，计算公式为：喷干粉得粉率（%）=喷干粉量/清膏含固量×100[11]。

2.3 四种成分含量测定方法

2.3.1 色谱条件

采用Agilent TC(2) C18 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 µm）；以甲醇、0.1%磷酸溶液构成的双相溶剂系统按表3 所示进行梯度洗脱[14]；每分流速为0.8 mL；色谱柱温度为30℃；检测波长为245 nm；进样量为10 µL。

表3 梯度洗脱表

2.3.2 对照品溶液的制备

精密称取尿苷、腺苷、鸟苷、(R,S)-告依春对照品适量，加水制成质量浓度分别为79.6204、63.1798、68.8744、142.9000 µg·mL-1的混合对照品溶液。

2.3.3 供试品溶液的制备

精密称取板蓝根喷干粉1.0 g，置具塞锥形瓶中，加入50 mL 水，密塞，称定重量，设定数控超声波清洗器的功率为600 W、频率为40 kHz，进行20 min的超声处理，取出，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，过0.22 µm的微孔滤膜，取续滤液，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性试验

分别精密吸取空白溶剂、混合对照品溶液及供试品溶液，依法测定，记录色谱图[15]，如图1 所示，在相应的保留时间处，供试品溶液与混合对照品溶液色谱均被洗脱出相同的色谱峰，空白溶剂对应保留时间处无色谱峰出现，表明色谱条件具有良好的专属性。

图1 专属性试验HPLC色谱图

2.4.2 线性关系考察

分别精密吸取“2.3.2”项下混合对照品溶液，加甲醇稀释制成系列浓度的混合对照品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图[11,16]。以对照品质量浓度（µg∙mL-1）为横坐标（X），以峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，进行线性回归，得到各待测组分的回归方程及线性范围见表4。结果表明各成分在相应的浓度范围内与峰面积的线性关系良好。

表4 线性关系考察结果

2.4.3 精密度试验

精密吸取“2.3.2”项下混合对照品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件连续进样6 次[17]，计算尿苷、腺苷、鸟苷、(R,S)-告依春色谱峰峰面积的RSD 均小于3%，表明仪器精密度良好。

2.4.4 重复性试验

取同一份板蓝根喷干粉，按“2.3.3”项下方法平行制备6 份供试品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件进样测定[11]。计算尿苷、腺苷、鸟苷、(R,S)-告依春含量的RSD均小于3%，表明该方法重复性良好。

2.4.5 稳定性试验

精密吸取“2.3.3”项下同一份供试品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件分别在0、2、4、6、8、12、24 h 进样测定[11]，计算尿苷、腺苷、鸟苷、(R,S)-告依春色谱峰峰面积的RSD均小于3%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.4.6 加样回收率试验

取已知含量的板蓝根喷干粉适量，精密称取9份，每份约0.5 g，置具塞锥形瓶中，分为3 组，每组分别按高、中、低浓度精密加入混合对照品溶液。按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积[18]，计算加样回收率及RSD，见表5。结果表明尿苷、腺苷、鸟苷、(R,S)-告依春的平均加样回收率分别为99.96%、99.61%、97.42%、98.20%，RSD 分别为1.74%、2.75%、2.18%、1.24%。表明该方法准确度良好。

TCP协议的通信过程为：服务器端必须首先通过指定IP地址以及端口名建立侦听，等待客户端响应连接；然后客户端向对应的服务器所设定的IP地址和端口发出连接请求；待服务器与客户端成功建立连接后，双方方可通过读写函数控件收发数据，完成数据传输时，需先从客户端断开连接后服务器才能断开连接。

表5 加样回收率试验结果（n = 9）

2.5 数据处理

熵值法是一种基于差异驱动的客观赋权法，即根据各个指标在总体中的变异程度赋予权重[19]。指标变异程度越大，则信息熵越小，能提供的有效信息就越多，其赋予的权重也就越大[20]。

①数据无量纲处理：由于不同指标之间数量级不同，需要对数据进行标准化处理。本文根据公式：无量纲化值（Yij）＝（实测值－最小值）/（最大值－最小值）对原始数据进行处理，即

式（1）中Xij表示第i次试验中j项指标所得试验值。

②消零处理：原始数据无量纲化处理后数据的最小值为0，为了使数据有意义，本文对Yij的最小值0 取0.001。

③数据归一化处理：根据公式对数据进行归一化处理，即计算第i次试验在j项指标下的概率，计算公式：

式（2）中n表示试验组数。

④各指标信息熵计算：根据公式：

⑥各指标熵权系数计算：根据公式：

式（5）中Wj表示第j项指标的权重值，m 表示试验指标个数。

2.6 板蓝根喷雾干燥工艺优化

2.6.1 确定关键工艺参数（CPPs）和关键质量属性（CQAs）

中药喷雾干燥过程的影响因素主要包括：工艺参数、药液、环境、设备[21-22]，见图2。根据生产经验及文献查阅[22-24]，初步选取药液相对密度、药液温度、进液速度、进风温度和雾化压力作为影响板蓝根喷雾干燥工艺的CPPs。2020 年版《中国药典》一部板蓝根项下对(R,S)-告依春成分进行定量控制[1]，国家药典委员会颁布的《关于中药配方颗粒国家药品标准（第一批）的公示》项下“008.板蓝根配方颗粒（编号：YBZ-PFKL-2021008）”同样对(R,S)-告依春进行定量控制，同时标准中的特征图谱中以尿苷、腺苷、鸟苷、(R,S)-告依春作为特征峰[14]。研究表明，核苷类成分是板蓝根抗病毒作用的主要活性成分[25]，选取以上4 个成分进行含量测定对板蓝根配方颗粒质量控制具重要意义。板蓝根喷干粉的得粉率直接影响生产产量，因此将得粉率和尿苷、腺苷、鸟苷、(R,S)-告依春的含量作为板蓝根喷雾干燥工艺的CQAs。

图2 板蓝根配方颗粒喷雾干燥工艺参数筛选鱼骨图

2.6.2 PBD试验筛选CPPs

Plackett-Burman 试验设计可通过较少的试验从众多影响因素中快速、准确、高效地筛选出显著因素[26]。以药液相对密度（A）、药液温度（B）、进液速度（C）、进风温度（D）、雾化压力（E）为自变量，以得粉率（Y1）和尿苷（Y2）、腺苷（Y3）、鸟苷（Y4）、（R,S）-告依春（Y5）的含量作为CQAs，采用Minitab 16.0 软件设计试验，试验由五因素两水平组成，共12 组试验。试验设计及结果见表6、表7。

表6 PBD试验设计因素水平表

表7 PBD试验结果

对PBD 试验结果进行方差分析，结果见表8，可知药液相对密度（A）和进液速度（C）对OD值的影响显著（P<0.05），其它三个因素对OD 值无显著影响，故下一步选择药液相对密度和进液速度作为优化试验的关键工艺参数。

表8 PBD试验的方差分析结果

2.6.3 CCD试验优化关键工艺参数

基于上述PBD 试验设计结果的基础上，采用CCD进一步优化板蓝根配方颗粒喷雾干燥工艺。以药液相对密度（A）和进液速度（C）为关键考察因素，控制其余3个不显著影响因素的水平分别为进风温度175℃，药液温度50℃，雾化压力0.5 Mpa，采用Design Expert 8.0.6软件设计试验，试验设计及结果见表9、表10。

表9 CCD试验设计因素水平表

表10 CCD试验结果

采用Design Expert 8.0.6 软件对表10 中的数据进行处理，以药液相对密度（A）、进液速度（C）为自变量，Y1-Y5的总评OD 值为因变量，进行多元回归分析，并进行方差分析和拟合优度分析。由模型拟合结果，发现二次多项式模型拟合方程有显著意义，回归方程为OD=-93.09408+165.51492A+0.31313C-0.24187AC-73.58594A2-0.000742375C2，其方差分析见表11，药液相对密度（A）、进液速度（C）对OD 值影响的三维效应面图和等高线图，见图3。

图3 药液相对密度和进液速度对OD值影响的响应面图与等高线图

表11 回归模型的方差分析及拟合优度分析

由表11可知，回归模型P<0.05，失拟项P>0.05，表明该方程模型显著性高，拟合度良好，失拟项无统计学意义，未知因素对试验干扰较小，可用于板蓝根配方颗粒喷雾干燥工艺参数优化过程的预测。回归模型中A、C、AC、A2、C2的P值均小于0.05，说明均对OD值影响显著。由图3 可知，当药液相对密度一定时，OD 值随进液速度的增加而增大；当进液速度一定时，OD值随药液相对密度的增加而增加。

2.7 设计空间建立

在设定的参数空间内搜索满足OD 值大于0.65 的所有因素组合，同时设置α=0.05 水平的置信区间，即构成设计空间，结果用Overlay polt 展示，见图4。图中亮黄色区域为加入95%置信区间后的设计空间，在此设计空间所有的点都符合工艺目标的期望值，暗黄色区域为原设计空间内不可靠的部分，在此空间的所有点有5%的概率无法满足工艺目标。因设计空间并不规则，不便对二者进行严格控制[12]，为了便于操作，推荐的操作空间范围药液相对密度为1.05-1.08，进液速度为30%-40%。

图4 板蓝根配方颗粒喷雾干燥工艺设计空间

2.8 设计空间验证试验

在设计空间内随即选取6个工艺设计参数进行验证，用来检验所建模型的预测能力[27]。1 号、2 号、3 号为95%置信区间内的点（亮黄色区域），4 号、5 号、6 号为原设计空间内，95%置信区间外的点（浅黄色区域）[12]，验证试验结果见表12。对表12中OD 值的实测值与预测值进行配对样本t检验，结果P值大于0.05，表明实测值与预测值无显著差异，可见模型具有良好的预测能力。

表12 验证试验结果

3 讨论

近年来，质量源于设计（QbD）理念正在推动制药生产模式的转变，并获得了广泛的关注[28]，QbD 理念在中药制剂工艺设计的各个方面均有应用，包括饮片炮制、提取、分离纯化、干燥、制剂等，旨在提高工艺稳定性和产品质量可控性[25]。QbD 理念的核心是设计空间的建立，设计空间是能保证工艺品质的关键物料属性和工艺参数的范围组合[29-30]。本文便是基于QbD 理念，在Plackett-Burman 试验的基础上，通过CCD 构建了板蓝根喷雾干燥过程中CQA 与工艺CPPs 的回归模型及工艺设计空间，并进行了验证，验证结果表明工艺参数在该设计空间内能保证板蓝根配方颗粒喷雾干燥过程和产品质量的稳定。