PI3K/AKT 信号通路与乳腺病变弹性特征的相关性

姜莹，王博，李诗雨，牛瑞兰，李俊康，王知力*

1.南开大学医学院，天津 300071；2.解放军总医院第一医学中心超声诊断科，北京 100853；*通信作者 王知力wzllg@sina.com

乳腺癌是185个国家女性人群中最常见的癌症类型，是女性患者死亡的主要原因[1]。I期乳腺癌患者5年生存率接近100%，但IV期乳腺癌的5年生存率下降至28%[2]。因此，乳腺癌的早期诊断是临床亟待解决的问题。剪切波弹性成像以量化的形式显示组织硬度以获得病变的生物学信息，在鉴别乳腺良、恶性病变方面具有良好的诊断准确性[3-4]。细胞外基质的降解不仅是触发癌症转移的关键，还会伴随不同肿瘤特异性细胞外基质沉积导致密度及硬度增加。本课题组前期研究表明，细胞外基质成分的变化与乳腺病变弹性特征密切相关[5]。乳腺癌组织中的异常磷脂酰肌醇-3-激酶/丝苏氨酸蛋白激酶（phosphatidylinositol 3 kinase/serine-threonine kinase，PI3K/AKT）信号通路激活可以引起细胞骨架的变化，导致细胞蛋白质重排和肿瘤间质重塑，进而使组织硬化和增强，在乳腺癌的侵袭和转移中发挥重要作用[6-9]。但PI3K/AKT信号通路与乳腺病变的弹性特征是否具有相关性目前鲜有报道。本研究拟探讨PI3K/AKT信号通路与乳腺病变弹性特征的相关性，为进一步阐明乳腺病变剪切波弹性模量改变的机制打下基础。

1 资料与方法

1.1 研究对象 前瞻性分析2021年5月—2022年5月于解放军总医院接受手术切除的114例女性患者共115个乳腺病变，以手术病理结果为“金标准”。纳入标准：①病理诊断明确；②临床、病理及预后随访信息完整。排除标准：①接受活检或新辅助化疗；②缺少重要的组织病理学结果，如缺少术后腋窝淋巴结病理。患者年龄18～71岁，平均（45±10）岁；病灶最大直径0.56～7.30 cm，平均（2.20±0.89）cm。手术前进行常规超声和剪切波弹性成像检查。本研究经解放军总医院伦理委员会批准（S2021-683-01），所有患者均签订知情同意书。

1.2 仪器与方法 采用SuperSonic Imagine AixPlorer实时剪切波弹性成像超声诊断仪，L15-4线阵探头，频率4～15 MHz。患者取仰卧位，充分暴露双侧乳房及腋窝，常规超声检查记录乳房病变的图像特征后转换为剪切波弹性成像模式，不施压的情况下固定探头，嘱患者屏气，图像稳定3 s后冻结储存图像。使用机器自配的定量测量软件选取感兴趣区测量弹性值。为了与组织病理学数据进行比较，选择乳腺病变最大成像切面测量乳房病变的最大弹性模量值、平均弹性模量值、最小弹性模量值，并测量取样框所置病灶处与周围同等深度正常乳腺组织的弹性模量比值，重复3次取平均值，并记录病变边缘有无出现“硬环征”。

1.3 PI3K/AKT表达的测定 采用4%多聚甲醛对乳腺病变组织进行固定、石蜡包埋，切成厚度为4 μm的石蜡切片。脱蜡水化后，在Tris-EDTA抗原修复液（Solarbio）中煮沸15 min进行抗原修复。室温下采用过氧化酶阻断溶液处理切片10 min以消除内源性过氧化物酶。室温下用山羊血清工作液（中山金桥）封闭30 min后，用鼠单克隆抗PI3K、兔多克隆抗体p-PI3K（Thermo Fisher Scientific）、兔单克隆抗体AKT（Cell Signaling Technology）、兔单克隆抗体p-AKT（Cell Signaling Technology）等分别孵育，4℃过夜。第1天用辣根过氧化物酶偶联的兔二抗或鼠二抗（Signalway antibody）室温孵育1 h。采用DAB底物试剂盒（中山金桥）进行显色，苏木精反染，密封阅片。染色结果由2名病理学专家独立评估。采用Image-Pro Plus 6.0软件分析免疫组化染色结果。从每个切片中选取5个感兴趣区（×200）并拍照。用平均光密度（AOD=IOD/area）评价PI3K/AKT的表达。

1.4 统计学方法 应用SPSS 25.0软件，计量资料以±s表示，组间比较采用单因素方差分析或独立样本t检验；计数资料以百分比（%）表示，组间比较采用χ2检验。以病理结果为“金标准”，分别绘制各因素的受试者工作特征（ROC）曲线，采用曲线下面积评价疗效。采用Spearman相关分析PI3K/AKT表达水平与乳腺病变弹性参数的相关性。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 乳腺病变病理结果 115个乳腺病变中，病理结果显示良性病变50个，包括纤维腺瘤28个、硬化性腺瘤10个、炎性病变6个（急性化脓性乳腺炎5个、肉芽肿性小叶性乳腺炎1个）、导管内乳头状瘤5个、良性叶状瘤1个；恶性病变65个，包括浸润性癌60个（浸润性导管癌46个、浸润性小叶癌6个、浸润性导管及小叶癌4个、黏液癌4个）、导管原位癌5个。根据术后病理判断恶性病变是否伴腋窝淋巴结转移（axillary lymph node metastasis，LNM），分为LNM组25例和无LNM组40例。

2.2 乳腺病变剪切波弹性成像定量参数分析 乳腺病变恶性组的最大弹性模量值、平均弹性模量值以及与周围组织弹性比值显著高于良性组。LNM组的最大弹性模量值、平均弹性模量值以及与周围组织弹性比值显著高于无LNM组。58.5%的乳腺恶性病变具有“硬环征”表现，显著高于良性组。92%的LNM具有“硬环征”表现，显著高于无LNM组（P均＜0.001；图1，表1）。

图1 乳腺病变剪切波弹性成像。A.良性乳腺病变（箭），最大弹性模量值为21.5 kPa，平均弹性模量值为18.6 kPa，病变与周围组织弹性比值为2.3；B.乳腺癌不伴LNM（箭），最大弹性模量值为109.2 kPa，平均弹性模量值为64.7 kPa，病变与周围组织弹性比值为4.0；C.乳腺癌伴LNM（箭），最大弹性模量值为136.3 kPa，平均弹性模量值为73.8 kPa，病变与周围组织弹性比值为5.7

2.3 PI3K/AKT表达水平及与弹性特征的相关性 乳腺良性病变、无LNM组及LNM组PI3K表达水平差异有统计学意义（F=15.19，P＜0.001），其中良性病变组与无LNM组、LNM组PI3K表达水平两两比较，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。PI3K表达水平与乳腺病变与最大弹性模量值、平均弹性模量值、周围组织弹性比值呈正相关（r=0.475、0.475、0.451，P＜0.001）。乳腺良性病变、无LNM组、LNM组p-PI3K表达水平比较，差异有统计学意义（F=58.95，P＜0.001）。其中良性病变组与无LNM组、LNM组p-PI3K表达水平两两比较，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。p-PI3K表达水平与乳腺病变最大弹性模量值、平均弹性模量值、周围组织弹性比值呈正相关（r=0.533、0.540、0.542，P＜0.001）。乳腺良性病变、无LNM组、LNM组AKT表达水平差异有统计学意义（F=46.94，P＜0.001）。其中良性病变组与无LNM组、良性病变组与LNM组AKT表达水平差异均有统计学意义（P均＜0.05），LNM组与无LNM组AKT表达水平差异无统计学意义（P=0.343）。AKT表达水平与乳腺病变最大弹性模量值、平均弹性模量值、周围组织弹性比值呈正相关（r=0.371、0.402、0.445，P＜0.001）。乳腺良性病变、无LNM组、p-AKT表达水平差异有统计学意义（F=74.21，P＜0.001）。其中良性病变组与无LNM组、良性病变组与LNM组p-AKT表达水平差异均有统计学意义（P均＜0.05），LNM组与无LNM组p-AKT表达水平差异无统计学意义（P=0.867）。p-AKT表达水平与乳腺病变最大弹性模量值、平均弹性模量值、周围组织弹性比值呈正相关（r=0.482、0.455、0.545，P＜0.001）。见表1及图2。

图2 免疫组化染色结果（×200）。A.良性乳腺病变PI3K表达；B.乳腺癌不伴LNM的PI3K表达；C.乳腺癌伴LNM的PI3K表达；D.良性乳腺病变p-PI3K表达；E.乳腺癌不伴LNM的p-PI3K表达；F.乳腺癌伴LNM的p-PI3K表达；G.良性乳腺病变AKT表达；H.乳腺癌不伴LNM的AKT表达；I.乳腺癌伴LNM的AKT表达；J.良性乳腺病变p-AKT表达；K.乳腺癌不伴LNM的p-AKT表达、L.乳腺癌伴LNM的p-AKT表达

2.4 PI3K/AKT表达及乳腺病变弹性特征对乳腺病变的诊断效能 周围组织弹性比值、最大弹性模量值、平均弹性模量值、“硬环征”、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT表达水平诊断乳腺病变良恶性的ROC曲线见图3A，其曲线下面积分别为0.910（0.857～0.963）、0.870（0.807～0.933）、0.857（0.790～0.924）、0.772（0.686～0.859）、0.860（0.774～0.947）、0.897（0.832～0.963）、0.898（0.839～0.958）、0.896（0.822～0.971）；周围组织弹性比值、最大弹性模量值、平均弹性模量值、“硬环征”、PI3K、p-PI3K预测乳腺癌是否伴淋巴结转移的ROC曲线见图3B，其曲线下面积分别为0.824（0.726～0.922）、0.710（0.578～0.841）、0.788（0.669～0.906）、0.773（0.657～0.888）、0.736（0.616～0.855）、0.724（0.589～0.858）。AKT及p-AKT表达预测乳腺癌是否伴淋巴结转移差异无统计学意义（P＞0.05）。

图3 PI3K/AKT表达及乳腺病变弹性特征对乳腺病变的诊断效能。A.病变的弹性特征及PI3K/AKT鉴别诊断乳腺良、恶性病变的ROC曲线；B.病变的弹性特征及PI3K/AKT预测乳腺癌是否伴淋巴结转移的ROC曲线

3 讨论

3.1 剪切波弹性成像对乳腺病变的诊断价值 乳腺癌的发病率和死亡率始终在女性患者中居高位[10-11]，其治疗策略的选择取决于腋窝淋巴结状态[12-13]。乳腺癌组织学分级、淋巴血管浸润等与乳腺癌的硬度密切相关[14-16]。剪切波弹性成像可以量化组织的硬度信息，本研究发现，最大弹性模量值、平均弹性模量值、病变与周围组织弹性比值及“硬环征”鉴别良、恶性病变均具有很好的效能，其预测乳腺癌LNM同样具有重要价值，与既往研究一致[17-19]。

3.2 PI3K/AKT信号通路蛋白在乳腺病变中的表达PI3K/AKT信号通路是一条重要的细胞内信号传导途径，其中约60%的乳腺癌会过度激活PI3K/AKT通路，在促进细胞增殖、抑制细胞凋亡等病理过程中具有重要作用[20-22]。本研究采用免疫组化方法检测良性乳腺病变、无LNM以及LNM组织中PI3K、磷酸化p-PI3K与AKT、磷酸化p-AKT表达，结果显示，乳腺恶性病变组织中PI3K、磷酸化p-PI3K与AKT、磷酸化p-AKT表达均显著高于良性病变，与既往研究结果一致[23-24]。但与以上研究不同，本研究发现在预测LNM中PI3K、磷酸化p-PI3K具有较好的临床价值，但AKT、磷酸化p-AKT表达无显著差异，其原因可能与样本量小、标本处理、抗体使用有关。

3.3 PI3K/AKT信号通路蛋白表达水平与乳腺病变弹性特征的相关性 PI3K/AKT信号通路的异常激活还可以影响组织的生理特性，其中之一是导致组织僵硬[25]。这种组织僵硬可能会影响癌症的发展和进展，包括肿瘤细胞增殖、转移和治疗抵抗等。乳腺癌组织中的异常PI3K/AKT信号通路激活可以引起细胞骨架的变化，导致细胞蛋白质重排和肿瘤间质重塑，进而导致组织硬化和增强[9,21]。但目前乳腺病变中PI3K/AKT信号通路的表达与剪切波弹性参数是否具有相关性尚未明确。本研究表明，乳腺病变的最大弹性模量值、平均弹性模量值及病变与周围组织弹性比值与PI3K、p-PI3K 与AKT、p-AKT 表达水平呈正相关，提示PI3K/AKT对乳腺病变的弹性有一定调控作用。

3.4 本研究的局限性 入组患者未考虑分子分型、组织学分级等因素；样本量较小，存在一定的选择偏倚，需要后续纳入更大样本量进一步细化研究和验证。

总之，乳腺病变的PI3K/AKT表达水平与最大弹性模量值、平均弹性模量值及病变与周围组织弹性比值等均具有相关性，提示其在乳腺病变弹性特征的调控中发挥重要作用。