富硒乳酸菌的制备

陈丹，曹亚莉，刘文雅，苗梦雅，毕小惠，王烁骞

商丘市产品质量检验检测研究中心（商丘 476000）

硒（Se）是人体所必需的微量元素，具有抗氧化、调节生长发育和抗病毒等作用。每天摄入足够量的硒，其类似于人体每日所需要的蛋白质和维生素[1]。有研究发现，动物机体中的胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px），硒是必需的组成元素[2]。硒元素的安全摄入量范围非常小，大于400 μg/d时，将可能出现中毒[3]。

益生菌（Probiotics）指有益活性的微生物，机体摄入之后，可以产生更多本身有的基本营养价值，具有保健作用[4]。益生菌能促进生长、提高营养物的利用率以及预防腹泻[5]。较无机硒，有机硒更容易被人体吸收且毒性低。益生菌将无机硒有机化，使其与体内的蛋白质结合，由此得到富硒益生菌，这样可以兼具有机硒和益生菌的作用[6]。研究表明富硒益生菌可以促进生长、增强免疫力、延缓衰老以及预防疾病[7]。国内外市场上的大多数产品中富硒和益生菌是两个单独的产品概念。少数产品同时提出富硒和益生菌2个概念，采用的方式是将含硒化合物与益生菌混合，试验以富硒益生菌为载体开发新产品，兼具益生菌和富硒2项功能，具有创新性。

1 方法

1.1 试验试剂与设备

主要试剂信息见表1。

表1 试验用试剂列表

试验主要仪器设备如表2所示。

表2 主要仪器设备

1.2 技术路线（图1）

图1 技术路线

1.3 富硒菌种的培养基正交试验

考察的因素有碳源添加量、氮源添加量、复合氮源添加比例、无机盐添加量。借助正交设计助手软件，根据表3和表4，采用L9(34)正交表进行试验。离心发酵液，收集菌体，于65 ℃烘干至恒重。

表3 因素水平表

表4 各试验组培养基配比

2 结果与分析

2.1 富硒益生菌筛选试验硒含量测定结果

由表5可得，硒添加量在0～1 000 mg/kg范围时，嗜酸乳杆菌的硒含量均为最高。因此，嗜酸乳杆菌的耐硒能力最强。

表5 试验菌株冻干粉的硒含量测定结果

硒浓度低于0.1 mg/kg时，各试验组的硒浓度差异不显著。硒浓度增加到1 mg/kg时，嗜酸乳杆菌的硒含量与其他3种菌的硒含量差异均极显著，这可能是因为这个浓度的硒对其他3种乳酸菌的增殖影响较大，是一个界限值，而对嗜酸乳杆菌的增殖影响不显著。硒浓度添加量10 mg/kg时，硒浓度已对4种乳酸菌的增殖都产生明显影响，植物乳杆菌与嗜酸乳杆菌对高浓度的硒有较强的耐受性。硒浓度添加量高于100 mg/kg时，嗜酸乳杆菌的硒含量与植物乳杆菌的硒含量仍然差异不显著。结果表明植物乳杆菌与嗜酸乳杆菌对高浓度的硒的耐受性较高，但嗜酸乳杆菌的硒含量较植物乳杆菌仍稍高。

2.2 富硒菌种生长曲线的测定结果

由图2可得，0～2 h为适应期，2～6 h为对数期，6 h至试验10 h均为稳定期，试验未测量嗜酸乳杆菌的衰亡期。

图2 嗜酸乳杆菌的生长曲线

2.3 富硒菌种的培养基优化

由试验可得，嗜酸乳杆菌的最佳培养基配比为蔗糖总添加量5%，蛋白胨与酵母膏添加比例3∶2，牛肉膏与蛋白胨总添加量0.35%，K2HPO4总添加量0.1%。

2.4 嗜酸乳杆菌的富硒菌种的制备结果

由表6和表7可得，添加的硒溶液硒含量为0.2，1和16 mg/kg时，嗜酸乳杆菌冻干粉的硒含量平均数分别为53.46，541.01和5 779.45 mg/kg，符合菌种硒含量的要求，即硒含量在5×103～6×103，5×102～6×102和50～60 mg/kg范围之内。

表6 嗜酸乳杆菌梯度富硒试验1硒含量结果

表7 嗜酸乳杆菌梯度富硒试验2硒含量结果

2.5 嗜酸乳杆菌增殖培养基响应面优化试验

2.5.1 Box-Behnken设计方案及响应值结果

根据Box-Behnken设计方案，试验得到得率及硒含量，如表8所示。

表8 Box-Behnken设计方案及响应值

表9 得率的回归模型方差分析结果

2.5.2 回归模型的建立与方差分析

对17组数据进行回归分析，得率拟合方程为得率=67.640 03+0.168 72A+12.476 57B+22.317 26C+3.608 59×10-4AB+2.247 85×10-4AC+1.041 77BC-2.839 96×10-5A2-0.648 12B2-3.020 77C2（R2=0.955 8），其中A为菌种含硒量，B为加硒量，C为加硒时间。

结果显示：A、A2及C2项极显著；BC和B2项显著。由回归模型的F值为16.82可知，该方程极显著。另外，由F值结果表明三因素对得率影响次序为A＞C＞B。最影响得率的因素是菌种硒含量，这是由于菌种对加硒环境的适应能力起决定作用[8]，菌种对高硒环境的适应能力越强，得率越高。

对上述17组数据进行回归分析，硒含量拟合方程为硒含量=-19 778.721 80+6.599 31A+2 199.822 67B+1 926.372 62C-0.018 895AB-0.082 680AC+6.753 85BC-9.921 54×10-4A2-71.522 83B2-134.657 47C2（R2=0.968 6），其中A为菌种含硒量，B为加硒量，C为加硒时间。

表10结果显示：A2、B2及C2项极显著；C和AC项显著。由回归模型的F值为23.95可知，该方程极显著；另外，由F值结果表明三因素对硒含量影响次序为C＞B＞A。最影响硒含量的因素是加硒时间，这是由于菌种对加硒环境的适应能力起决定作用[9]，菌种对高硒环境的适应能力越强，得率越高，而增加环境硒含量的时间越早越不利于菌体对硒的富集[10]。

表10 硒含量的回归模型方差分析结果

2.6 最优制备工艺的确定

运用Design Expert软件，得到得率最高的最优工艺：菌种硒含量2 902.81 mg/kg，加硒量15.30 mg/kg，加硒时间6.64 h。由该反应条件可以得到得率为498.46 mg/kg，硒含量为13 039.62 mg/kg。为检验以上最优工艺的可靠性，采用最优条件制备富硒嗜酸乳杆菌冻干粉，测定得到富硒嗜酸乳杆菌冻干粉的得率为466.67±33.33 mg/kg，与理论预测值相比相对标准偏差为7.14%。硒含量为13 003.01±299.12 mg/kg，与理论预测值相比相对标准偏差为2.30%。因此，此优化工艺参数准确可靠。

3 结论

根据富硒乳酸菌的筛选试验结果，嗜酸乳杆菌的富硒能力优于其他3种乳酸菌。通过对嗜酸乳杆菌的生长曲线的测定及硒含量对嗜酸乳杆菌活菌数的影响，试验发现硒添加量0～1 000 mg/kg时，发酵8 h后，嗜酸乳杆菌冻干粉的活菌数的数量级均能达到千亿级（即1×1011）。优化益生菌的培养基配方，最优增殖培养基配方为蔗糖总添加量5%，蛋白胨与酵母膏添加比例3∶2，蛋白胨与酵母膏总添加量0.35%，K2HPO4总添加量0.1%。优化富硒益生菌的发酵工艺，得到嗜酸乳杆菌的最佳富硒工艺：菌种硒含量2 902.81 mg/kg，加硒量15.30 mg/kg，加硒时间6.64 h。在此条件下，富硒益生菌产品得率为498.46 mg/kg，硒含量为13 039.62 mg/kg。通过检验试验，证明该优化工艺参数准确可靠。