红色邻米草菌S2-4-1HT产六氢环庚基灵菌红素摇瓶发酵条件的优化

傅俊杰 ，李世琪，董乐 ，林晓思 ，黄兆斌，王芳

1.福建省海洋藻类活性物质制备与功能开发重点实验室（泉州 362000）；2.泉州师范学院海洋与食品学院（泉州 362000）

灵菌红素（prodiginines，PGs）家族是一类由三吡咯结构组成的微生物生物碱类天然红色色素[1]。PGs家族中的灵菌红素（prodigiosin，PG）于粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）中首次被发现[2]，并从该菌中分离出PG纯品[1]。目前，PGs已被发现存在于沙雷氏菌属（Serratia）、假单胞菌属（Pseudomonas）、弧菌属（Vibrio）等多种微生物中[3-12]。据报道，已鉴定结构的PGs包括PG、十一烷基灵菌红素、庚基灵菌红素（heptylprodigiosin，hPG）、间环灵菌红素、链玉红菌素B、灵菌红素R1、壬基灵菌红素、甲基环庚基灵菌红素、类灵菌红素以及盐酸环状灵菌红素等[13]。此实验室从红色邻米草菌（Spartinivicinus ruber）菌株S2-4-1HT中分离鉴定获得六氢环庚基灵菌红素（six hydrogen cycloheptane prodigiosin，ShcPG）和hPG[10]，两种化学结构见图1[14]。研究表明，PGs具有抗肿瘤[15]、抗炎症细胞因子[16]和抗细菌[17]等生物活性。非常重要的是，PGs对正常细胞系具有低毒性或无毒性[17]。在PGs的研究与开发上，PG相对较为深入。PG已被用于各种癌症的实验药物，且用其作为先导物合成的灵菌红素衍生物（GX15-070或简称obatoclax）被用于治疗晚期慢性淋巴细胞白血病的Ⅰ期临床试验，并被证明具有良好的安全性[18]。PGs在临床药物开发、环境处理、食品添加剂制备等方面具有巨大的潜在应用价值，在全球市场上占有越来越重要的地位[19]。

图1 红色邻米草菌（S.ruber）菌株S2-4-1HT中分离鉴定获得的两种灵菌红素的化学结构[14]

微生物生产具有环境友好、条件温和、成本低、易于工业化的优点，因此，PGs的微生物生产被认为是其制备的发展方向[19]。高水平的微生物发酵色素产品依赖于优良的微生物菌株和有效的发酵方法。发酵生产取决于培养基组成、生产条件、发酵方法和微生物菌株等许多因素[20]，响应面法（response surface methodology，RSM）是同时考虑几个因素变化时优化工艺参数的最常用的统计工具。RSM不仅提供了关于直接效应、成对组合交互效应和变量参数的曲线变量效应的全面知识[21]，而且省时省力。

此实验室从红色邻米草菌菌株S2-4-1HT中分离鉴定了hPG和ShcPG（以下称hPG+ShcPG），其中ShcPG为首次发现，ShcPG的含量占hPG+ShcPG总含量的70%以上，并且ShcPG对肿瘤细胞A549的半抑制浓度（half-inhibitory concentration，IC50）值为0.226 1±0.026 1 μmol/L，其抑制效果为PG的25倍、顺铂的42倍[10]。因此，ShcPG具有极高的研究价值和抗肿瘤新药开发潜力。目前，如何优化微生物发酵条件、提高PGs产率依然是国内外学者的研究重点[22]。ShcPG的研究重点在于如何优化S.ruber菌株S2-4-1HT通过摇瓶发酵产ShcPG的工艺，以提高ShcPG的产率。此研究在前期采用RSM试验对菌株S2-4-1HT的hPG+ShcPG摇瓶发酵培养基配方进行优化的基础上，进一步通过单因素试验对菌株S2-4-1HT发酵条件进行考察，在此基础上分别通过RSM试验对菌株S2-4-1HT的hPG+ShcPG摇瓶发酵条件进行优化，以期得到稳定可靠的菌株S2-4-1HT摇瓶发酵产hPG+ShcPG的发酵工艺参数数据，旨在为ShcPG的工业化生产提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红色邻米草菌（S.ruber）菌株S2-4-1HT，此实验室分离鉴定并保藏于中国海洋微生物菌种保藏管理中心（保藏编号：MCCC 1K03745T=KCTC 72148T），已完成对该菌株的形态学观察、生理生化鉴定、16S rDNA鉴定。

PG（分子量：350 g/mol）、ShcPG（分子量：352 g/mol）：纯度均达98%以上，实验室纯化制备，华侨大学分析测试中心核磁鉴定；金龙鱼纯正花生油：嘉里粮油（青岛）有限公司；海生菌肉汤2216（Marine Broth 2216，MB）和琼脂粉：生物级，美国Becton，Dickinson and Company公司；酵母粉胰蛋白胨（生物级，美国OXOID公司）；其他试剂（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种活化

将此实验室保存的菌株解冻后划线接种于MB的固体培养基上，于28 ℃恒温培养48～72 h。挑取生长状态好的红色单菌落于MB的液体培养基中，于28 ℃，160 r/min振荡培养48 h，待培养液呈红色后于4 ℃冷藏，备用。MB液体培养基的配制：在1 000 mL去离子水中加入37.4 g MB粉；MB固体培养基的配制：在每升MB液体培养基中加入15.0 g琼脂粉。

1.2.2 发酵条件的优化

1.2.2.1 发酵培养基发酵条件单因素试验

在前期发酵培养基优化配方（花生油、蛋白胨、无水氯化钙、六水合氯化镁和柠檬酸铁的质量浓度分别为2.00，4.00，1.35，9.00和0.22 mg/mL）基础上，主要考察温度、培养基pH、培养基总盐度、培养时间对hPG+ShcPG产量的影响。因素水平见表1。

表1 发酵条件单因素试验因素水平表

1.2.2.2 发酵条件的RSM试验设计

根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，综合单因素试验结果，选取温度、pH和总盐度作为自变量，以S.ruber菌株S2-4-1HT发酵液中hPG+ShcPG质量浓度为响应值，进行三因素三水平的RSM试验，优化摇瓶发酵hPG+ShcPG的培养条件。试验因素和水平见表2。

表2 发酵条件优化试验的因素水平表

1.3 发酵液中hPG+ShcPG产量的测定

1.3.1 标准曲线的绘制

以hPG+ShcPG纯品为标准样品，以其无水乙醇溶液的质量浓度为横坐标，于535 nm波长处的吸光度（A535）为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程y=0.123 4x+0.012 5（R2=0.999 1），表明hPG+ShcPG纯品质量浓度在0.547 0～7.020 0 mg/L时，A535和hPG+ShcPG的质量浓度呈现良好的线性关系。

1.3.2 发酵液中hPG+ShcPG产量的测定

发酵完成后，将S.ruber菌株S2-4-1HT发酵液和乙酸乙酯按照1∶1体积混合，充分超声破碎菌体细胞，静置后取8 mL上清液于10 000 r/min离心5 min。将离心后上清液全部移至另一离心管中，待乙酸乙酯挥发完全即获得hPG+ShcPG产物。用无水乙醇溶解hPG+ShcPG产物并全部转移到10 mL比色管中，定容至5 mL。定容后的溶液于10 000 r/min离心5 min，移取上清液，采用比色法测定溶液中的hPG+ShcPG产量。

1.4 数据处理

所有试验的重复次数均为3次，数据表示为平均值±标准差。采用Design-Expert 8.0.6软件对发酵培养基配方和发酵条件进行RSM试验设计、方差分析及二次方差分析，绘制相应的等高线图和响应曲面图，采用Microsoft Office 2019进行基本的图表制作、绘制单因素试验相关曲线图。

2 结果与分析

2.1 发酵条件单因素试验

2.1.1 培养温度对hPG+ShcPG产量的影响

培养温度对S.ruber菌株S2-4-1HT发酵产hPG+ShcPG产量的影响见图2。当温度为22～31 ℃时，S.ruber菌株S2-4-1HT发酵产hPG+ShcPG产量呈上升趋势。当温度大于31 ℃时，hPG+ShcPG的产量急剧下降，并且当温度为31 ℃时，S.ruber菌株S2-4-1HT发酵产hPG+ShcPG产量达最大值，因此在S.ruber菌株S2-4-1HT发酵产hPG+ShcPG发酵的RSM法优化分析确定最佳工艺参数水平时，发酵温度适合选择在28～34 ℃。

图2 不同培养温度下hPG+ShcPG产量

2.1.2 培养基pH对hPG+ShcPG产量的影响

发酵培养基pH对S.ruber菌株S2-4-1HT发酵产hPG+ShcPG产量的影响见图3。当pH为6.0～7.0时，S.ruber菌株S2-4-1HT发酵产hPG+ShcPG产量呈上升趋势。当pH大于7.0时，hPG+ShcPG的产量急剧下降，并且当pH为7.0时，S.ruber菌株S2-4-1HT发酵产hPG+ShcPG产量达最大值，因此在S.ruber菌株S2-4-1HT发酵产hPG+ShcPG发酵的RSM法优化分析确定最佳工艺参数水平时，发酵培养基pH适合选择在6.0～8.0。

图3 不同pH培养基hPG+ShcPG产量

2.1.3 培养基总盐度对hPG+ShcPG产量的影响

发酵培养基总盐度对S.ruber菌株S2-4-1HT发酵产hPG+ShcPG产量的影响见图4。当总盐度为1.0～2.5%时，S.ruber菌株S2-4-1HT发酵产hPG+ShcPG产量呈上升趋势。当总盐度大于3.0%时，hPG+ShcPG的产量急剧下降，并且当总盐度为2.5%时，S.ruber菌株S2-4-1HT发酵产hPG+ShcPG产量达最大值，因此在S.ruber菌株S2-4-1HT发酵产hPG+ShcPG发酵的RSM法优化分析确定最佳工艺参数水平时，发酵培养基总盐度适合选择在2.0%～3.0%。

图4 不同总盐度培养基hPG+ShcPG产量

2.1.4 培养时间对hPG+ShcPG产量的影响

培养时间对S.ruber菌株S2-4-1HT发酵产hPG+ShcPG产量的影响见图5。当时间为36～48 h时，S.ruber菌株S2-4-1HT发酵产hPG+ShcPG产量呈上升趋势。当时间大于48 h时，hPG+ShcPG的产量急剧下降，并且当时间为48 h时，S.ruber菌株S2-4-1HT发酵产hPG+ShcPG产量达最大值，因此在S.ruber菌株S2-4-1HT发酵产hPG+ShcPG发酵的RSM法优化分析确定最佳工艺参数水平时，发酵时间适合选择48 h。

图5 不同培养时间下hPG+ShcPG产量

2.2 发酵条件RSM法优化分析

2.2.1 发酵条件RSM法试验设计与最佳工艺参数确定

在单因素试验的基础上，依据中心组合设计原理，采用三因素三水平的RSM分析法，以发酵液中hPG+ShcPG质量浓度为响应值，结果见表3。

表3 发酵条件RSM法试验设计及结果

利用Design-Expert 8.0.6对响应面试验结果进行二次多元回归分析，结果见表4。hPG+ShcPG质量浓度的回归方程为Y=4.05-1.41A+1.21B+0.71C-1.06AB-0.054AC+0.66BC-0.91A2-1.87B2-0.86C2。由表4可知，模型P＜0.01，失拟项为0.606 9，表明模型具统计学意义。此试验所得模型决定系数R2=0.986 2，说明建立的数学回归模型拟合度较好，校正系数Radj2=0.968 3，说明该模型可以解释96.83%的响应值变化。试验因素中一次项A、B、C，交互项AB、BC以及二次项A2、B2、C2对S.ruber产hPG+ShcPG的影响具统计学意义（P＜0.01），交互项AC影响无统计学意义（P＞0.05）。结果表明，相关因素对此次试验具有较大的影响，响应值的变化不是简单的线性关系。

表4 hPG+ShcPG发酵条件RSM中心组合设计的方差分析

通过Design-Expert 8.0.6软件，根据响应面试验结果建立的回归方程进行分析和拟合，得到响应面对应的等高线图和响应曲面图，见图6。响应面图中若图形越陡峭，则说明两因素间的交互作用影响越具统计学意义（P＜0.05），越平坦说明影响越不具统计学意义（P＞0.05）。等高线图可以根据其图形的形状来判断其交互影响的程度，若图形为椭圆且密集则交互现象影响越具统计学意义（P＜0.05）。

图6 温度，pH与总盐度对hPG+ShcPG产量影响的响应曲面图和等高线图

由响应面分析图进一步分析了3个因素对S.ruber菌株S2-4-1HT发酵产hPG+ShcPG产量的作用。图6-A和图6-E中三维曲面图较陡峭，且图6-B和图6-F中等高线图形接近椭圆形，表明温度与pH、pH与总盐度的交互作用影响具统计学意义（P＜0.05）。图6-C中三维曲面图较陡峭，但图6-D高线图形接近圆形，表明温度与总盐度的交互作用影响不具统计学意义（P＞0.05）。

若将交互项AC从回归方程中剔除，且将其平方和及自由度并入试验误差，进行第二次方差分析，结果见表5。

表5 hPG+ShcPG发酵条件RSM中心组合设计的二次方差分析

二次方差分析结果表明，各项均具统计学意义（P＜0.05）且失拟项不具统计学意义（P＞0.05），故hPG+ShcPG质量体积浓度的回归方程为Y=4.05-1.41A+1.21B+0.71C-1.06AB+0.66BC-0.91A2-1.87B2-0.86C2。

在3个试验因素的编码范围内，由Excel规划求解得到的发酵液中hPG+ShcPG产量的最佳发酵条件为培养温度28 ℃、pH 7.73和总盐度2.85%。在最佳发酵培养基配方条件下hPG+ShcPG产量预测值为5.62 mg/L。

2.2.2 最佳发酵条件工艺参数验证性试验

在前期优化最佳培养基配方工艺（花生油、蛋白胨、无水氯化钙、六水合氯化镁和柠檬酸铁的质量浓度分别为2.00，4.00，1.35，9.00和0.22 mg/mL）基础上，培养温度、pH和总盐度分别为28 ℃，7.73和2.85%，发酵时间48 h，S.ruber菌株S2-4-1HT发酵产hPG+ShcPG产量的工艺验证值为5.71±0.12 mg/L（n=3），与预测值差异无统计学意义（P＞0.05），证明了RSM法优化S.ruber菌株S2-4-1HT发酵产hPG+ShcPG的最佳培养条件的可行性。

3 结论

综合前期最佳发酵培养基配方和最佳发酵条件的试验结果，S.ruber菌株S2-4-1HT发酵产hPG+ShcPG的最佳发酵条件：培养基配方中花生油、蛋白胨、氯化钙、氯化镁和柠檬酸铁的质量浓度分别为2.00，4.00，1.35，9.00和0.22 mg/mL，培养基pH和总盐度分别为7.73和2.85%，发酵温度为28 ℃，发酵时间为48 h。在此工艺下，S.ruber菌株S2-4-1HT发酵产hPG+ShcPG的产量为5.71±0.12 mg/L，是用MB培养基培养产量的22.84倍，且预测值和测定值的绝对差值＜5%，表明回归模型可靠。此次试验对红色邻米草菌S2-4-1HT发酵开发生产ShcPG具有实际应用价值。