连翘配方颗粒与饮片的抗炎、抗肿瘤和抑菌效果的比较研究

郭新邓，郭卓琳，孙冬梅，邹丽芳，区锦莹，余林中，卢子滨，曹惠慧，刘俊珊

1南方医科大学中医药学院中药药理实验室//广东省中药制剂重点实验室//广东省中药制剂技术工程实验室，广东 广州 510515；2广东一方制药有限公司，广东 佛山528244

连翘是木犀科植物连翘的干燥果实，味苦、性微寒，入肺、心、小肠经，具有清热解毒，消肿散结，疏散风热等功效，被誉为“疮家圣药”，是临床常用的清热解毒中药。现代研究表明，连翘含有木脂素类、苯乙醇苷类、黄酮类和挥发油类等多种成分［1,2］，具有抗炎［3-5］、抗肿瘤［6,7］、抗菌［8］等药理作用，临床上常用于治疗急性呼吸道感染、肺炎、盆腔炎、肾炎等［9-11］。

中药配方颗粒是以中医药理论为指导，运用现代技术方法对单味中药饮片进行水提、浓缩、干燥、制粒等工艺制成，可供临床调剂直接使用的颗粒剂［12］。与中药饮片相比，配方颗粒具有易于调剂、携带及服用方便等优点［13］。随着《结束中药配方颗粒试点工作的公告》的发布，中药配方颗粒行业进入了新的阶段。虽然国家相继出台了相关标准，但中药配方颗粒仍然存在较多亟待解决的问题［14-16］，如药材质量难以控制、质量评价体系不完善、等效性基础研究薄弱等［17,18］。

斑马鱼是常见的模式动物之一，广泛用于药理学和毒理学等领域［19］，具有产卵周期短且量大、胚胎透明易于观察等优点。斑马鱼的基因组与人类基因组同源性较高，具有相似的炎症细胞和受体，易于模拟人类的炎症疾病［20］。斑马鱼炎症模型主要有硫酸铜、尾鳍横断和LPS显微注射，其分别代表化学诱导、机械损伤和细菌感染所致炎症，可以多角度研究药物抗炎作用。在斑马鱼体内，其先天免疫系统在受精后2 d即可发挥作用，而适应性免疫系统在受精后28 d 才可成熟［21］。受精后2 d的斑马鱼胚胎由于免疫能力低下，注射癌细胞后无明显排斥反应，可用于构建异种移植模型［22］。目前斑马鱼胚胎已被证实为人类肿瘤异种移植的可靠系统［23］。

连翘作为大宗药材，入药历史悠久，临床使用量较大，配方颗粒与饮片是否存在药效学差异目前未见研究。本研究通过构建斑马鱼体内模型和体外抗菌实验，探究生药量相同下的连翘配方颗粒与饮片是否在抗炎、抗肿瘤、抗菌方面存在药效差异。

1 材料和方法

1.1 药物

连翘饮片来源于木犀科植物连翘的干燥果实，购买于康美药业股份有限公司，由南方医科大学晁志教授鉴定。连翘饮片提取物制备：称取100 g连翘，向其中加入十倍量水浸泡1 h，待武火煮沸后文火1 h，滤出药液。向滤渣中加入8倍量水，煎煮30 min。3层纱布过滤，再抽滤。采用旋转蒸发的方法将药液旋至100 mL左右，定容，得到1 g/mL的母液，采用冷冻干燥方法制成冻干粉。药液采用PBS配制。

连翘配方颗粒购买于广东一方制药公司，每克颗粒相当于饮片3.3 g。药液采用PBS配制。

1.2 试剂

硫酸铜（CuSO4·5H2O，国药集团化学试剂有限公司）；脂多糖（LPS，Sigma）；地塞米松磷酸钠溶液（5 mg/mL，广州白云山天心制药股份有限公司）；CM-DiL活细胞示踪剂(上海翌圣生物科技股份有限公司);索拉菲尼（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；AG RNA ex Pro RNA提取试剂（湖南艾科瑞生物工程有限公司）；Prime Script™RT Master Mix试剂盒（北京宝日医生物技术有限公司）；TB Green®Premix Ex Taq™II试剂盒（北京宝日医生物技术有限公司）；引物合成（上海生工生物工程有限公司）。

1.3 动物和细胞

本实验所用斑马鱼为转基因型斑马鱼（MPO-eGFP）和野生型斑马鱼（Wild-Type），其中转基因品系斑马鱼为标记中性粒细胞表达为绿色荧光蛋白，均由南方医科大学人类疾病斑马鱼模型和药物筛选重点实验室提供。斑马鱼的饲养条件：水温28～30 ℃，盐度为0.03%～0.04%，pH为7.2～7.6，喂食2次/d，光照14 h，黑暗10 h。人肺腺癌细胞系A549、人结直肠癌细胞系HCT116、人胰腺癌细胞系PANC-1、人肝癌细胞系Hep3B和人宫颈癌细胞系HeLa[中国科学院细胞所（上海）]。

1.4 仪器

斑马鱼养殖系统（上海海圣生物实验设备公司）；DS-11型超微量分光光度计（DeNovix）；PM1000型显微注射仪（微滴仪器）；PMP-102型可编程微针拉制器（MDI）；MVX10 型体式荧光显微镜（OLYMPUS）；Light Cycler®96型实时荧光定量PCR仪（Roche）；KFPRO-005型数字病理切片扫描仪（宁波江丰生物信息技术有限公司）；5804R 型冷冻离心机（Eppendorf）；EG1160型包埋仪（Leica）；HERA cell 240i型细胞培养箱（Thermo scientific）。

1.5 方法

1.5.1 斑马鱼胚胎的收集与培养 挑选健康的成年斑马鱼，雌雄比例为1∶1，放置于斑马鱼专用产卵缸内，用挡板将雌雄分开。次日光照开始时移除挡板，待斑马鱼交配后，收集鱼卵，放入含有0.02%亚甲基蓝的培养水中，置于28.5 ℃的恒温培养箱中孵化，每隔24 h更换培养水。

1.5.2 斑马鱼实验分组与给药 称取适量的连翘配方颗粒（LQKL）和连翘饮片冻干粉（LQYP），将其用PBS配成含生药量相同的溶液。斑马鱼炎症模型实验分为正常对照组、模型对照组、地塞米松组、连翘配方颗粒组和连翘饮片组，其中连翘配方颗粒组和连翘饮片组分别分为高中低剂量组（800、600、400 μg/mL）。斑马鱼肿瘤移植模型实验分为模型对照组（0组）、索拉菲尼组（250 nmol/L）、连翘配方颗粒组和连翘饮片组，其中连翘配方颗粒组和连翘饮片组分别分为高中低剂量组（800、600、400 μg/mL）。连翘配方颗粒组与连翘饮片组剂量均按生药量计算，即二者在同等生药量下进行药效比较。

1.5.3 斑马鱼急性毒性实验 挑选已孵化出且状态良好的2 dpf斑马鱼幼鱼，随机分配到各组，每组30条。设置0、100、300、500、700、900、1100、1300和1500 μg/mL的连翘配方颗粒和连翘饮片组，给药后，每隔24 h更换药液，观察死亡率和畸形率，直至72 h。

1.5.4 斑马鱼浸泡硫酸铜炎症模型实验［24］选取状态良好的3 dpf 斑马鱼幼鱼，随机分配成9 组，每组20条。除正常对照组外，其余各组均将斑马鱼浸泡于2 mL的20 μmol/L的CuSO4溶液中。除正常对照组、模型对照组外，分别给药地塞米松磷酸钠溶液或连翘两种剂型溶液。给药2 h后，将幼鱼置于琼脂板上，通过体式荧光显微镜观察斑马鱼侧线神经丘细胞区域的中性粒细胞分布和数量。对侧线神经丘细胞区域的中性粒细胞拍照计数，并进行统计分析。

1.5.5 斑马鱼尾部横断炎症模型实验［25］选取状态良好的3 dpf斑马鱼幼鱼，用0.03%三卡因溶液麻醉后，将鱼置于载玻片上，用手术刀切断幼鱼的尾鳍。在28.5 ℃的培养水中复苏后，随机分配到各组，每组15条，分别给药地塞米松磷酸钠溶液或连翘两种剂型溶液2 mL。正常对照组的斑马鱼不进行尾鳍横断处理。给药4 h后，将幼鱼置于琼脂板上，通过体式荧光显微镜观察斑马鱼尾部中性粒细胞的分布和数量，并且拍照计数，进行统计分析。

1.5.6 斑马鱼显微注射模型实验［26］选取状态良好的3 dpf斑马鱼幼鱼，用0.03%三卡因溶液麻醉后，向斑马鱼卵黄囊中注射2 nL的LPS（1 mg/mL）溶液建立炎症模型，其中正常对照组显微注射2 nL的磷酸缓冲盐溶液。在28.5 ℃的培养水中复苏后，随机分配到各组，每组30条，除正常对照组、模型对照组外分别给药地塞米松磷酸钠溶液或连翘两种剂型溶液2 mL。给药12 h后，将幼鱼置于琼脂板上，通过体式荧光显微镜观察斑马鱼卵黄囊中性粒细胞的分布和数量，并且拍照计数，进行统计分析。

1.5.7 斑马鱼显微注射72 h内生存分析实验 方法按1.5.6项，显微注射斑马鱼幼鱼卵黄囊，给药后于28.5 ℃培养箱中培养，每隔24 h更换斑马鱼含药培养水。观察72 h内斑马鱼幼鱼的存活状态，并记录各组的死亡数目，进行统计分析。

1.5.8 斑马鱼病理组织HE染色 方法按1.5.6项，显微注射斑马鱼幼鱼卵黄囊，给药后于28.5 ℃培养箱中培养12 h。将斑马鱼用PBS清洗2次，在4%的多聚甲醛中室温固定24 h。用擦镜纸包裹斑马鱼后用不同浓度乙醇逐级脱水，二甲苯透明，最后用石蜡包埋。蜡块切片，厚度约4 μm，进行HE染色，封片后在数字病理切片扫描仪下观察卵黄囊中病理组织变化并拍照。

1.5.9 实时荧光定量聚合酶链式反应 方法按1.5.6项，显微注射斑马鱼卵黄囊，给药后于28.5 ℃培养箱中培养12 h后，将斑马鱼用PBS清洗2次，从斑马鱼中提取总RNA。按照PrimeScript™RT Master Mix 试剂盒反转录得到cDNA，反转录条件为第1步为37 ℃，15 min；第2步为85 ℃，5 s；第3步为4 ℃，结束。根据TB Green®Premix Ex Taq™II试剂盒说明书进行Real-time PCR反应，反应条件为：第1步为预变性95 ℃，30 s，循环1次；第2步为PCR反应95 ℃，5 s，而后60 ℃，30 s，循环40次；第3步为融解曲线95 ℃，5 s，而后65 ℃，60 s，而后95 ℃，1 s，循环1次，4 ℃放置。采用2-ΔΔCt法，与内参肌动蛋白（β-actin）的表达水平进行相对定量分析，获得基因的mRNA表达水平。引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列见表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences for RT-qPCR

1.5.10 细胞培养及染色 细胞培养于含有10%胎牛血清的DMEM培养基中，于37 ℃，含5%二氧化碳的培养箱中培养，每2～3 d换1次液。当细胞长到80%或以上时对细胞进行传代。取对数生长期细胞，采用胰酶消化后，离心收集细胞再用完全培养基将其重悬，向其中加入终浓度为5 μg/mL 的CM-Dil 染液，于37 ℃中孵育30 min，每隔10 min涡旋以充分染色，再置于4 ℃染色15 min，离心收集细胞，用PBS洗2次用完全培养基重悬。显微镜下计数计算细胞的浓度后，用0.4%CMCNa重悬将细胞数量调整至1×107/mL，置冰上备用。

1.5.11 斑马鱼异种移植实验［27］选择状态良好的2 dpf斑马鱼幼鱼，用0.03%三卡因溶液麻醉后，向斑马鱼卵黄囊中注射2 nL的肿瘤细胞溶液，约每条幼鱼注射200个细胞，以建立肿瘤模型。模型采用人肺腺癌细胞系A549、人结直肠癌细胞系HCT116、人胰腺癌细胞系PANC-1、人肝癌细胞系Hep3B和人宫颈癌细胞系Hela这五种不同器官来源的肿瘤细胞评价连翘两种剂型的抗肿瘤药效差异。幼鱼注射后，在荧光显微镜下挑选细胞团的大小基本一致的进行实验，除模型对照组外，分别给药索拉菲尼溶液或连翘两种剂型溶液。于28.5 ℃培养箱中培养72 h后，荧光显微镜下观察斑马鱼卵黄囊的荧光情况。

1.5.12 微量肉汤稀释法 设置模型对照组、连翘配方颗粒和饮片各剂量组（500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.81、3.91、1.95 mg/mL），给药设置3个平行组。除模型对照组外，各组均加入10µL的肺炎链球菌菌液和100µL含药培养基。模型对照组向其中加入10µL肺炎链球菌菌液和100µL液体培养基。于37 ℃培养箱中培养24 h后，观察液体是否澄清，如澄清，药物具有抑菌作用［28］。

1.6 统计学分析

采用GraphPad Prism 9.0软件，对实验数据进行统计分析及作图，实验数据以均数±标准差表示，多组间比较运用One-way ANOVA，组间两两比较用LSD检验，其中1.5.7项斑马鱼显微注射LPS后72 h内存活，采用生存分析，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 斑马鱼72 h急性毒性实验结果

实验结果表明在浓度为100～1500 μg/mL时连翘饮片及其配方颗粒在72 h内均未对斑马鱼的生长发育造成明显影响，各组斑马鱼的死亡率和畸形率均为0%，因此选择非毒剂量作为后续实验浓度。

2.2 连翘饮片及配方颗粒抗炎药效比较研究结果

2.2.1 连翘对斑马鱼炎症模型免疫细胞的迁移和聚集的影响 硫酸铜炎症实验结果所示，与正常对照组相比，模型对照组在浸泡硫酸铜2 h后，斑马鱼的侧线神经丘细胞区域的中性粒细胞明显聚集且数量显著升高（P<0.001，图1A）。与模型对照组比较，地塞米松10μg/mL组抑制斑马鱼的中性粒细胞向侧线神经丘细胞区域迁移，各给药组中斑马鱼侧线神经丘细胞区域中性粒细胞的迁移聚集数量均显著降低（P<0.001，图1B）。连翘饮片与配方颗粒比较，发现在等剂量下两种剂型无明显差异。

图1 连翘对斑马鱼炎症模型免疫细胞的迁移和聚集的影响Fig.1 Effect of single extract of Forsythia Suspense(LQKL)and the prepared drug in pieces(LQYP)on neutrophil recruitment and aggregation in zebrafish inflammation models. A: Representative images of zebrafish models of CuSO4,LPS or tail transection-induced inflammation(scale bar=1 mm).B:Neutrophil counts in CuSO4-induced inflammatory model.C:Neutrophil counts in tail transection-induced inflammatory model. D: Neutrophil counts in LPS-induced inflammatory model.Data are presented as Mean±SD(n=5).***P<0.001 vs model group.

斑马鱼胚胎尾部横断后，与正常对照组比较，模型对照组的尾部横断处中性粒细胞的聚集数量显著升高（P<0.001，图1A）。与模型对照组比较，地塞米松10μg/mL组和连翘两种剂型给药组斑马鱼损伤部位的中性粒细胞聚集迁移数量均显著降低（P<0.001，图1C）。连翘饮片与配方颗粒比较，发现在等剂量下两种剂型抑制尾部炎症无明显差异。

斑马鱼显微注射LPS后，与正常对照组比较，模型对照组斑马鱼卵黄囊注射部位及周围的中性粒细胞数量显著升高（P<0.001，图1A），且多出现聚集性的中性粒细胞团。与模型对照组比较，地塞米松10 μg/mL组和连翘两种剂型给药组斑马鱼卵黄囊的中性粒细胞数量均显著降低（P<0.001，图1D）。连翘饮片与配方颗粒比较，发现两者在等剂量下无明显抗LPS诱导炎症的差异。

2.2.2 连翘对斑马鱼显微注射LPS模型存活率的影响与正常对照组比较，模型对照组的斑马鱼存活率显著降低（P<0.001，图2）。与模型对照组比较，地塞米松组和连翘各给药组的存活率均显著升高（P<0.01或P<0.001，图2）。可见连翘可以通过发挥抗炎作用提高注射了LPS斑马鱼幼鱼的存活率，且通过比较发现连翘饮片组与配方颗粒组在等剂量下无明显差异（P>0.05）。

图2 连翘对斑马鱼显微注射LPS模型存活率的影响Fig.2 Effect of different concentrations of the two dosage forms of Forsythia Suspense (LQKL and LQYP) on survival rate of zebrafish after LPS microinjection(n=30).***P<0.001,**P<0.01 vs model group.

2.2.3 连翘对斑马鱼显微注射LPS模型组织病理的影响 病理结果显示，注射PBS后未出现明显的中性粒细胞在卵黄囊部位聚集（图3）。而在显微注射LPS后，与正常对照组相比中性粒细胞迁移聚集明显增加。连翘两种剂型均出现不同程度抑制中性粒细胞向卵黄囊中聚集，其中连翘饮片组与连翘配方颗粒组比较无明显差异（P>0.05）。

2.2.4 连翘对斑马鱼显微注射LPS 模型炎症因子mRNA的影响 斑马鱼注射LPS刺激后，与正常对照组比较，模型对照组斑马鱼的炎症因子Tnfα和Il6 的mRNA表达水平显著升高（P<0.001，图4A、B）。与模型对照组比较，连翘饮片及配方颗粒各组斑马鱼体内炎症因子的表达均显著降低（P<0.01或P<0.001，图4A、B）。在等剂量下比较连翘饮片组和连翘配方颗粒组对Tnfα和Il6 的抑制作用时，发现仅给药浓度为400 μg/mL时连翘配方颗粒与饮片在抑制Il6 存在显著性差异（P<0.01，图4B），并且连翘配方颗粒效果优于连翘饮片，其余各组均无显著性差异。

图4 连翘对斑马鱼显微注射LPS模型炎症因子及相关机制mRNA的影响Fig.4 Effect of Forsythia Suspense (LQKL and LQYP at equivalent dose) on the mRNA expression levels in LPS stimulated zebrafish(Mean±SD,n=3).***P<0.001,**P<0.01,*P<0.05 vs model group.#P<0.05,##P<0.01.

斑马鱼被LPS刺激后，与正常对照组比较，模型对照组的P38、Jnk、Erk和P65的mRNA表达水平显著升高（P<0.001，图4C～F）。与模型对照组比较，连翘饮片及配方颗粒各组斑马鱼体内P38、Jnk、Erk 和P65 的mRNA表达均显著降低（P<0.05或P<0.01或P<0.001，图4C～F）。

在等剂量下比较连翘饮片组和连翘配方颗粒组对P38、Jnk、Erk和P65的抑制作用时，发现在抑制P38和Erk上两种无显著差异。在抑制Jnk的mRNA表达中连翘配方颗粒与连翘饮片在400、600 μg/mL组存在显著性差异（P<0.05或P<0.01，图4C），且连翘配方颗粒效果优于连翘饮片。在抑制P65的mRNA表达中连翘配方颗粒与连翘饮片在400 μg/mL 组存在显著性差异（P<0.05，图4F），且连翘配方颗粒效果优于连翘饮片。

2.3 连翘饮片及配方颗粒抗肿瘤的药效比较研究结果

2.3.1 连翘对HCT116细胞增殖的影响 与模型对照组相比，除连翘饮片400µg/mL外，连翘饮片及配方颗粒各组均可以显著抑制HCT116细胞的增殖（P<0.001，图5A、B）。在等剂量下比较连翘饮片组与连翘配方颗粒组，发现除400µg/mL组药效存在显著性差异（P<0.01，图5A、B）外，其余各组均无显著性差异。病理切片结果见图5C，模型对照组中可见大量肿瘤细胞，与模型对照组比较，发现经索拉菲尼、连翘饮片和连翘配方颗粒处理后肿瘤细胞均减少。

图5 连翘对HCT116细胞增殖的影响Fig.5 Effect of Forsythia Suspense(LQKL and LQYP at equivalent dose)on HCT116 cell proliferation in zebrafish.A:Representative images of zebrafish xenograft model(scale bar=1 mm).B:Quantitative analysis of the fluorescent area in zebrafish(Mean±SD,n=5).C:HE staining(scale bar=100 μm).***P<0.001 vs model group(0 μg/mL).##P<0.01.

2.3.2 连翘对Hep3B细胞增殖的影响 与模型对照组相比，连翘饮片及配方颗粒各组均可以显著抑制Hep3B细胞的增殖（P<0.001，图6A、B）。在等剂量下比较连翘饮片组与连翘配方颗粒组，各组均无显著性差异。病理切片结果见图6C，模型对照组中可见大量肿瘤细胞，与模型对照组比较，发现经索拉菲尼、连翘饮片和连翘配方颗粒处理后肿瘤细胞均减少。

图6 连翘对Hep3B细胞增殖的影响Fig.6 Effect of Forsythia Suspense (LQKL and LQYP) on Hep3B cell proliferation in zebrafish.A: Representative images of zebrafish xenograft model (scale=1 mm). B: Quantitative analysis of the fluorescent area in zebrafish(Mean±SD,n=5).C:HE staining(scale bar=100 μm).***P<0.001 vs model group.

2.3.3 连翘对A549细胞增殖的影响 与模型对照组相比，连翘饮片及配方颗粒各组均可以显著抑制A549细胞的增殖（P<0.001，图7A、B）。在等剂量下比较连翘饮片组与连翘配方颗粒组，各组均无显著性差异。病理切片结果见图7C，模型对照组中可见大量肿瘤细胞，与模型对照组比较，发现经索拉菲尼、连翘饮片和连翘配方颗粒处理后肿瘤细胞均减少。

图7 连翘对A549细胞增殖的影响Fig.7 Effect of Forsythia Suspense (LQKL and LQYP) on A549 cell proliferation in zebrafish. A: Representative images of zebrafish xenograft model (scale=1 mm). B: Quantitative analysis of the fluorescent area in zebrafish(Mean±SD,n=5).C:HE staining(scale bar=100 μm).***P<0.001 vs model group.

2.3.4 连翘对HeLa细胞增殖的影响 与模型对照组相比，连翘饮片及配方颗粒各组均可以显著抑制HeLa细胞的增殖（P<0.05或P<0.01或P<0.001，图8A、B）。在等剂量下比较连翘饮片组与连翘配方颗粒组，各组均无显著性差异。病理切片结果见图8C，模型对照组中可见大量肿瘤细胞，与模型对照组比较，发现经索拉菲尼、连翘饮片和连翘配方颗粒处理后肿瘤细胞均减少。

图8 连翘对HeLa细胞增殖的影响Fig.8 Effect of Forsythia Suspense(LQKL and LQYP)on HeLa cell proliferation in zebrafish.A:Representative images of zebrafish xenograft model (scale bar=1 mm). B: Quantitative analysis of the fluorescent area in zebrafish(Mean±SD,n=5).C:HE staining(scale bar=100 μm).*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 vs model group.

2.3.5 连翘对PANC-1细胞增殖的影响 与模型对照组相比，除400 μg/mL外连翘饮片及配方颗粒各组均可以显著抑制PANC-1 细胞的增殖（P<0.05 或P<0.01 或P<0.001，图9A、B）。在等剂量下比较连翘饮片组与连翘配方颗粒组，各组均无显著性差异。病理切片结果见图9C，模型对照组中可见大量肿瘤细胞，与模型对照组比较，发现经索拉菲尼、连翘饮片和连翘配方颗粒处理后肿瘤细胞均减少。

图9 连翘对PANC-1细胞增殖的影响Fig.9 Effect of Forsythia Suspense(LQKL and LQYP)on PANC-1 cell proliferation in zebrafish.A:Representative images of zebrafish xenograft model (scale=1 mm). B: Quantitative analysis of the fluorescent area in zebrafish(Mean±SD,n=5).C:HE staining(scale bar=100 μm).*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 vs model group.

2.4 连翘对肺炎链球菌增殖的影响

连翘饮片及配方颗粒均可以对肺炎链球菌起到抑制作用。两者均在15.63 mg/mL时起到抑菌作用，即为其最小抑菌浓度MIC（表2），因此两者在抑菌药效上无明显差异。

表2 连翘对肺炎链球菌增殖的影响Tab.2 Effect of Forsythia Suspense(LQKLand LQYP)on proliferation of Streptococcus pneumoniae

3 讨论

本研究着眼于药效作用等效性这一关键问题，通过斑马鱼构建炎症和肿瘤细胞异种移植模型评价连翘传统饮片及其配方颗粒是否存在抗炎和抗肿瘤药效差异，通过体外抑菌实验评价两种剂型是否存在抑菌药效差异。

尽管目前尚未见连翘配方颗粒及传统饮片抗炎作用的比较研究，但连翘提取物的抗炎活性已被广泛报道并在临床证实［29］。本研究采用斑马鱼炎症模型对连翘两种剂型的抗炎作用进行评价，实验结果表明二者均具有抗炎作用，且连翘配方颗粒的抗炎活性优于连翘传统饮片。我们推测该差异可能是由于制备工艺的不同导致挥发油含量改变所致。连翘配方颗粒人为的添加了连翘挥发油包合物，而连翘饮片遵照传统煎药方式势必造成挥发油的损失。前期罗林［30,31］也报道了连翘挥发油存在抗炎作用，这进一步证实了我们的推测。

连翘具有消肿散结的功效，且有文献报道连翘提取物具有广谱抗肿瘤活性，如A549 细胞、Hep3B 细胞、MCF-7细胞等［32,33］。本研究通过斑马鱼异种移植肿瘤模型移植人肺腺癌A549细胞、人结直肠癌HCT116细胞、人胰腺癌PANC-1细胞、人肝癌Hep3B细胞和人宫颈癌Hela细胞，从不同器官来源的肿瘤细胞多角度比较评价连翘饮片与配方颗粒的抗肿瘤的药效差异。实验结果表明连翘饮片及配方颗粒各组对斑马鱼体内移植的A549、HCT116、PANC-1、Hep3B和Hela细胞的增殖起到抑制作用。斑马鱼异种移植HCT116细胞的实验中仅在400µg/mL剂量下连翘配方颗粒组与连翘饮片组的抗肿瘤的药效存在差异。

研究发现连翘对多种细菌有抑制作用如肺炎链球菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等［34,35］，为研究两种剂型是否在抑菌药效存在差异，本研究采用微量肉汤法比较评价连翘配方颗粒及饮片在抑制肺炎链球菌上的药效差异。实验结果表明连翘两种剂型均可以抑制肺炎链球菌的存活，且两者均在15.63 mg/mL起到抑菌作用，因此两者在抑菌作用上无明显差异。

综上，本研究评价了连翘配方颗粒及饮片的药效，发现连翘两种剂型均具有抗炎、抗肿瘤和抑菌作用。在等剂量下，两种剂型抗炎方面仅在作用机制部分指标存在显著性差异；在抗肿瘤方面，两种剂型对HCT116细胞抑制作用存在差异；在抑菌方面两者无明显差异。本研究通过对连翘配方颗粒和饮片的药效比较，为临床使用连翘配方颗粒提供了科学依据，为后续其他中药配方颗粒的药效比较提供了一定的研究思路。但是需要指出的是，由于复方共煎后可能出现有效成分含量升高，药效增加，毒性降低的优点［36-38］，且中药主要以复方使用，因此研究中药复方配方颗粒与中药饮片复方的药效作用等效性是后续研究的重点。目前，我们也正在进行中有关连翘经典名方的配方颗粒和饮片共煎复方的药效对比研究。