miR-26b-3p 靶向CREB1 调控神经胶质瘤细胞的增殖、迁移及侵袭

黄秋虎，周 建，王子珍，杨 堃，陈政纲

海南医学院第一附属医院神经外科，海南 海口570102

胶质瘤是颅内最常见的原发恶性肿瘤，一般由于其具有高度侵袭性和手术难以全切，因此预后极其不佳，多数患者中位生存期仅12～15月［1］。近年来，胶质瘤的基础与临床研究虽然取得了重大突破，新的治疗手段层出不穷，但有效的干预措施依然很少，严重影响胶质瘤患者的预后［2,3］。从其发生发展的分子机制入手，寻找可干预的致病基因以及药物治疗靶点，具有重要临床价值和社会意义。研究表明，微小RNA（miRNAs）与胶质瘤的恶性发生、发展密切相关［4,5］。miRNA前体产生的两条miRNA单链（3p和5p链）都具有生物学功能［6-8］。从miR-26b前体的3'端臂加工而来的miR-26b-3p可通过多种机制调节细胞侵袭和增殖［9,10］。我们前期研究表明，miR-26b表达随着胶质瘤级别的增加逐渐降低［11］。然而，miR-26b-3p 在胶质瘤中的作用以及靶点目前仍不完全清楚，需要进一步探索。环磷酸腺苷效应元件结合蛋白1（CREB1）是调节基因转录、细胞发育与生存的核转录因子，主要通过cAMP依赖的细胞信号转导途径调控基因的表达［12］。研究表明，CREB1在细胞生长、增殖、凋亡等的过程中发挥重要作用［13,14］。有研究表明CREB1的表达随着胶质瘤级别增加而增加［15］，但其在胶质瘤中的作用机制尚不明确。我们利用生物信息学软件预测发现，miR-26b-3p在CREB1 mRNA的3'UTR区有多个潜在的靶点，预示miR-26b-3p 可能调控CREB1蛋白表达水平，参与胶质瘤的生物学进展，但相关研究未见报道。本研究旨在阐明miR-26b-3p靶向调控CREB1在胶质瘤中的作用机制，以及miR-26b-3p对胶质瘤增殖、迁移和侵袭能力的影响，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 临床标本采集及处理

收集2016年6月～2021年6月在我院收治的75例星形细胞瘤患者的病理标本，其中男40例，女35例，年龄为41～73（49.23±3.67）岁。所有患者术前均未行放疗、化疗，其中，星型细胞瘤Ⅰ级5例、Ⅱ级25例、Ⅲ级25例、Ⅳ级20例。肿瘤组织离体后分为2块，一块迅速置入RNA长效保存液中，另一块使用焦碳酸二乙酯处理过的冷磷酸缓冲液冲洗，并去除血渍，迅速投入液氮中保存。所有临床样本收集均取得海南医学院第一附属医院伦理委员会批准（2022-L-146）及患者知情同意。

1.2 细胞株及主要试剂

人脑胶质瘤细胞U251（上海生命科学研究院），Lipofectamine®2000转染试剂盒（Invitrogen），二甲基亚砜（DMSO，Sigma），胎牛血清，DMEM 培养基（Life Technologies），miR-26b-3p PCR引物、抑制序列、阴性对照（NC）序列均由Invitrogen公司合成，BCA蛋白检测试剂盒（碧云天），CREB1抗体（CST），Trizol试剂盒（Life Technologies），SYBR Premix Ex TaqTM（Takara），PCR仪（Thermo），蛋白凝胶成像仪（Bio-Rad），流式细胞仪（Beckman）。

1.3 方法

1.3.1 细胞分组 从液氮中取出人脑胶质瘤细胞系U251接种于培养基培养内，然后进行传代培养，当细胞培养至第3 代时用于后续实验。通过转染试剂盒将NC、miR-26b-3p mimic及miR-26b-3p inhibitor片段，参照Lipofectamine®2000 说明书转染胶质瘤细胞U251，转染24 h后在荧光显微镜下观察荧光结果确认转染效率。

1.3.2 CCK-8实验 在离心管中配置好已经稳定转染的适量细胞悬液，然后将细胞悬液均匀滴加到96孔板中，每组设置3个复孔，然后将96孔板放于37 ℃细胞孵育箱中培养。24 h后取出96孔板，置于倒置显微镜中观察细胞贴壁及生长情况。在避光条件下于每孔中加入10 μL的CCK-8溶液，然后置入细胞孵育箱中，分别于12、24、48、72 h重复上述的步骤，加入CCK-8溶液后用酶标仪检测细胞在450 nm处的吸光度。

1.3.3 伤口愈合实验 用无血清培养基将U251细胞接种至6 孔板中，各组细胞以50 nmol/L 的浓度转染细胞。24 h后用在标记线处进行划痕，并在划痕0、24、48、72 h后观察划痕中细胞的覆盖情况，即细胞的迁移能力，并用Image J软件测定两处的直线距离，重复测量3次，取其均数。

1.3.4 Transwell实验 各组细胞以50 nmol/L的浓度转染U251细胞24 h，然后将U251细胞使用无血清培养基重悬，并在铺有基底膜基质胶的Transwell 上室中接种。在下室中加入含10%FBS的胎牛血清培养液，培养24 h后，保留室内下层细胞，并用棉签清理未迁移的细胞，加入4%的多聚甲醛固定10 min，结晶紫染液染色15 min，在倒置显微镜下随机挑选5个视野进行计数，实验重复3次，取其均数作为这个小室的侵袭细胞数。

1.3.5 双荧光素酶报告基因检测 利用TargetScan、JASPAR等网站对miR-26b-3p调控CREB1的靶位点进行预测。在萤光素酶报告载体中构建了一个包含野生型（WT）或突变型（MUT）CREB1 3'UTR假定结合位点的3'UTR序列，然后构建相应的质粒。取对数生长期的U251 细胞接种于96 孔板中，按照Lipofectamine®2000的操作指南与设计的载体和miR-26b-3p mimic/NC mimic片段进行共转染，然后继续培养48 h后，检测海参荧光素酶的发光强度与萤火虫荧光素酶发光强度。

1.3.6 细胞凋亡检测 转染后的各组细胞继续培养48 h，制备单细胞悬浮液，调整细胞密度为5×104/mL接种；加入预冷PBS漂洗，然后离心，保留下层细胞，用70%乙醇固定30 min；PBS漂洗，然后加入AnnexinV-FITC、PI（1∶2）进行重悬，避光孵育60 min（4 ℃），采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。

1.3.7 RT-qPCR检测 各组细胞培养后加入细胞裂解液进行裂解，按照RNA 提取试剂盒说明书提取细胞总RNA，采用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，miR-26b-3p 引物为：F:5':GGCCTGTTCTCCATTACTTG G3'，R:5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。U6引物：F:5'-ATGCACAGTCTATAGATTT-3'，R:5'-GCT ATACGAACGTGCATCC-3'；CREB1 mRNA引物为：F:5-TGCCACATTAGCCCAGGTATC-3'，R:5-GGACTT GAACTGTCTGCCCA-3'；GAPDH 引物为：F:5'-GTG AAGGTCGGAGTCAACGG-3'，R:5'-CCCGTTCTCA GCCATGTAGT-3'；反应体系为20 μL: SYBR Premix 10 μL，H20 8 μL，cDNA 1 μL，上下游引物0.5 μL。反应程序：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性15 s、60 ℃退火20 s，72 ℃3 min，共40个循环，72 ℃延伸10 min。以GADPH作为内参基因，根据2-ΔΔCT算法进行计算CREB1 mRNA表达量；以U6作为内参基因计算miR-26b-3p mRNA表达量。

1.3.8 Western blotting 转染后各组细胞培养48 h，加入蛋白裂解液反应30 min，离心后收集上清液，按照细胞总蛋白提取试剂盒说明书提取细胞总蛋白，采用BCA法测定所提取蛋白的浓度。然后配制分离胶及浓缩胶，上样、电泳，加入CREB1，4 ℃孵育过夜，TBST漂洗后加入二抗，于室温下孵育2 h；TBST漂洗后ECL显色，置于凝胶成像仪中显像。

1.4 统计学分析

采用SPSS29.0建立数据库进行统计分析。符合正态分布且方差齐的计量资料以均数±标准差表示，两组均数的比较采用Student'st检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同级别胶质瘤中miR-26b-3p和CREB1的表达

RT-qPCR结果显示，miR-26b-3p mRNA表达水平随着胶质瘤级别的增加而逐渐下降（P<0.05，图1C）；CREB1的mRNA及蛋白表达水平随着胶质瘤级别的增加而逐渐增加（P<0.05，图1A、B、D）。

图1 不同级别胶质瘤中miR-26b-3p及CREB1的表达情况Fig.1 Expression of miR-26b-3p and CREB1 in gliomas of different pathological grades.A,B:Western blotting of expression of CREB1 in different stages of glioma. C, D: RT-qPCR of miR-26b-3p in different stages of glioma.*P<0.05 vs WHO I group.

2.2 miR-26b-3p mimic 转染后miR-26b-3p 和CREB1 mRNA的表达

miR-26b-3p mimic转染人胶质瘤细胞U251 48 h后，miR-26b-3p mimic组miR-26b-3p mRNA的表达水平提高(P<0.001，图2A)；miR-26b-3p mimic组CREB1 mRNA的表达水平降低(P<0.001，图2B)。

图2 转染miR-26b-3p mimic后miR-26b-3p和CREB1 mRNA的表达情况Fig.2 mRNA expression of miR-26b-3p(A)and CREB1(B)detected by RT-qPCR in U251 cells transfected with miR-26b-3p mimic.***P<0.001 vs NC group.

2.3 miR-26b-3p靶向调控CREB1

利用TargetScan、JASPAR等网站进行生物信息学预测显示CREB1的3′UTR 区域上存在与miR-26b-3p匹配的核苷酸序列（图3A）。双荧光素酶报告基因检测结果表明，过表达miR-26b-3p mimic 可显著抑制CREB1 WT的相对荧光素酶活性（P<0.01），而CREB1 MUT的相对荧光素酶活性无明显变化（P>0.05，图3B）。RT-qPCR 和Western blotting 检测结果显示，过表达miR-26b-3p的U251细胞中CREB1 mRNA及蛋白表达水平均比NC组细胞降低（P<0.01，图3C～E）。

图3 双荧光素酶报告基因验证CREB1作为miR-26b-3p的靶基因Fig.3 Dual luciferase reporter gene experiment confirms that CREB1 is the target gene of miR-26b-3p.A:Bioinformatics prediction of the binding site in CREB1 for miR-26b-3p.B:Luciferase reporter assay confirms that miR-26b-3p is capable of binding to CREB-WT but not to CREB1-MUT in U251 cells.C:RT-qPCR of CREB1 mRNA in U251 cells transfected with miR-26b-3p mimic. D: Western blotting of CREB1 expression in U251 cells transfected with miR-26b-3p mimic; E: Quantification of Western blotting results.**P<0.01 vs NC group.

2.4 miR-26b-3p靶向调控CREB1对胶质瘤细胞增殖的影响

在U251 细胞中转染了miR-26b-3p mimic、miR-26b-3p inhibitor及NC片段。CCK-8结果显示，过表达miR-26b-3p mimic可抑制U251细胞的增殖作用，miR-26b-3p inhibitor 可促进U251 细胞的增殖（P<0.05，图4A）；Western blotting结果显示miR-26b-3p mimic可抑制CREB1的表达，miR-26b-3p inhibitor可促进CREB1的表达（P<0.05，图4B、C）。

图4 miR-26b-3p靶向调控CREB1对胶质瘤细胞增殖能力的影响Fig.4 MiR-26b-3p targets CREB1 to regulate U251 cell proliferation.A:Viability of cells measured by MTT assay.B,C:Western blotting of CREB1 expression in U251 cells transfected with NC,miR-26b-3p mimic and miR-26b-3p inhibitor.*P<0.05 vs NC group.

2.5 miR-26b-3p靶向调控CREB1对胶质瘤细胞凋亡的影响

流式细胞术的研究结果显示，转染miR-26b-3p mimic 的U251 细胞凋亡率增加，转染miR-26b-3p inhibitor的U251细胞凋亡率下降（P<0.05，图5）

图5 流式细胞术检测各组胶质瘤细胞凋亡率Fig.5 MiR-26b-3p targets CREB1 to regulate apoptosis of U251 cells.A:U251 cells stained with FITC-Annexin V-PI and analyzed by flow cytometry.B:Quantitative analysis of apoptosis in U251 cells transduced with miR-26b-3p.*P<0.05 vs NC group.

2.6 miR-26b-3p靶向调控CREB1对胶质瘤细胞迁移及侵袭的影响

划痕愈合实验结果显示，与NC组相比，转染miR-26b-3p mimic的U251细胞在24、48、72 h时，胶质瘤细胞迁移率均降低，转染miR-26b-3p inhibitor的U251细胞在24、48、72 h时，胶质瘤细胞迁移率均增加（P<0.05，图6A、B）。

图6 miR-26b-3p对U251细胞迁移和侵袭能力的影响Fig.6 Effect of miR-26b-3p expression level on migration and invasion of U251 cells.A:Scratch wound healing assay of U251 cells in different groups.B:Quantitation of wound migration ratio at different time points.C:Quantitation of the number of invading cells.*P<0.05 vs NC group.

Transwell实验结果显示，与NC组相比，转染miR-26b-3p mimic后通过基质胶的胶质瘤细胞减少，转染miR-26b-3p inhibitor后通过基质胶的胶质瘤细胞增多，差异有统计学意义（P<0.05，图6C）。

3 讨论

胶质瘤是中枢神经系统中最常见的恶性肿瘤之一，由于其呈浸润性生长，手术难以全切，且对放、化疗敏感性差，术后复发率高，多数患者中位数生存率低，这与胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移等恶性生物学行为密切有关［16］。miRNAs是一类由约20个核苷酸组成的小型非编码RNA分子，参与高等真核细胞内多种生物作用的调控。研究表明，miRNAs与肿瘤的发病机制密切相关，包括细胞增殖、迁移和侵袭等。miRNAs的异常表达是由多种癌症类型的基因改变所致，并通过靶基因表达的失调在肿瘤的发生和发展中发挥作用。我们前期研究表明miR-26b 在胶质瘤中低表达，可通过下调COX-2表达抑制神经胶质瘤的增殖、侵袭和迁移［11］，表明miR-26b 在恶性胶质瘤的发生和发展中发挥抑癌作用。miR-26b-3p作为抑癌基因或致癌基因，在胆管癌、食管癌、乳腺癌、结肠癌、喉癌等多种恶性肿瘤中均有表达［17-20］，并且对肿瘤恶性进展发挥重要作用。研究表明，miR-26b-3p在神经胶质瘤中表达明显上调，可通过靶向调控TRA2B、ANTXR1调节胶质瘤增殖、迁移［10,21］。然而，其关键作用靶点及具体作用机制尚不完全清楚，仍需进一步研究。

为进一步验证miR-26b-3p在胶质瘤的表达水平，本研究检测了不同级别胶质瘤中miR-26b-3p的表达水平，其结果显示miR-26b-3p在胶质瘤中低表达，并且随着胶质瘤级别的增加其表达水平逐渐下降，表明miR-26b-3p在恶性胶质瘤中发挥抑癌基因的作用，可阻止胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力，这与既往研究［14,21］结果相似。

CREB1是肿瘤细胞增殖和迁移过程的一个关键核转录因子［12,22］。研究表明，CREB1在乳腺癌、肝细胞癌、前列腺癌、肾癌等多种肿瘤的发生发展中发挥重要作用，促进肿瘤细胞的增殖和迁移［14,23-25］。有学者发现抑制CREB1的表达可有效减少胰腺癌细胞的迁移和增殖［26］。也有研究表明，CREB1在高级别胶质瘤组织中的表达上调，而下调CREB1表达可以抑制胶质瘤细胞的增殖和侵袭能力［15］，但CREB1在神经胶质瘤进展中的作用仍不清楚。基于此，本研究进一步探索CREB1在胶质瘤中的作用，临床数据和体外实验结果表明，CREB1的表达随着胶质瘤级别增高而增加，且CREB1的表达与胶质瘤病理分级密切相关，表明CREB1在恶性胶质瘤进展中充当致癌基因，并且可能与神经胶质瘤恶性肿瘤的严重程度相关。miRNAs 可通过靶向CREB1基因的表达而在多种肿瘤中发挥抑癌基因的作用［27］，miR-27b-3p的表达水平与乳腺癌组织中CREB1水平负相关［28］。miR-200b靶向调控CREB1抑制胶质瘤的生长［29］。miR-138 通过靶向CREB1 抑制AKT/mTOR信号通路，调节神经胶质瘤细胞的增殖、凋亡和侵袭［30］。基于此，本研究通过TargetScan、Jaspar等数据库分析了miR-26b-3p潜在的下游转录调控因子，发现CREB1可能是miR-26b-3p的潜在靶基因。为探索胶质瘤细胞中miR-26b-3和CERB1之间的作用及相关机制，利用双荧光素酶报告基因检测方法，我们证实了CREB1是miR-26b-3p的新靶基因。运用RNA 干扰技术，过表达miR-26b-3p可显著抑制CERB1的表达，表明胶质瘤中CREB1蛋白的表达受miR-26b-3p的负调控。进一步通过流式细胞仪对胶质瘤细胞的凋亡情况进行检测发现，下调胶质瘤细胞中miR-26b-3p 表达，胶质瘤细胞的凋亡率显著提高，而且其迁移及侵袭能力明显下降，表明miR-26b-3p 可通过调节CREB1作为神经胶质瘤抑制因子，影响胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭等恶性生物学行为。

但本研究尚存在一定的局限：在恶性胶质瘤中，miR-26b-3p及CREB1的上下游可能存在其他的调控机制尚需进一步研究；能否找到其他的作用靶点、能否在恶性胶质瘤的诊治中发生重要作用，还需进一步探索。

综上所述，本研究首次在恶性胶质瘤细胞中研究miR-26b-3p 和CREB1 的相互作用及相关机制，发现miR-26b-3p可靶向负调控CREB1表达抑制胶质瘤细胞的增殖、侵袭、迁移能力，促进胶质瘤细胞的凋亡，从而参与胶质瘤的发生、发展。因此，miR-26b-3p/CREB1可作为胶质瘤诊断或治疗的新靶点。