转BtCry1Ac基因对107杨材性的非预期影响*

李洪瑞,赵志明,张津,门艳阔,张子杨,王进茂

(1.河北农业大学 林学院,河北 保定 071000;2.河北省洪崖山国有林场,河北 易县 074200)

杨树(Populus)为杨柳科(Salicaceae)杨属(PopulusL.)多年生落叶乔木,在我国是重要的绿化及工业用材树种[1]。目前我国杨树林总面积达到了825.49×104hm2,居世界首位[2]。107杨(Populus×euramericana‘74/76’)是北方欧美杨主栽杨树品种之一。杨树大规模单一品种的应用导致了日益严重的病虫害问题,利用基因工程技术加快杨树抗虫新品种研发进程显得尤为重要。迄今为止,已有近22个转Bt基因抗虫杨树品种被培育出来,并被批准进行小规模田间试验和环境释放[3]。转基因生物非预期效应是指由于外源基因整合于基因组,整合行为或整合后的转录产物与翻译产物会对宿主原有的基因表达造成干扰导致的非目标性的性状改变[4]。张德建等[5-6]在研究转基因741杨与非转基因741杨的材性差异时发现,转基因741杨的密度、部分力学性质和化学组分含量均与对照有显著差异。有研究表明,转Cry1Ac-Cry3A-BADH基因107杨在株高和胸径的生长上弱于对照,植物激素转导和木质素合成相关基因产生了差异表达[7]。Ning等[8]在对转基因杨与非转基因杨的形成层组织代谢组学分析比较中表明,共发现了197种丰度不同的代谢物,其中包括与生长和胁迫相关的精氨酸和谷氨酸,与细胞壁相关的蔗糖、尿苷二磷酸葡萄糖及其衍生物和与抗虫相关的儿茶酚。木材的性质是影响杨木应用的关键因素,为了探究转基因株系的生产应用相关性状是否发生了改变,本研究以转BtCry1Ac基因107杨的两个株系(ECA1、ECA2)和野生型株系(WT)为实验材料,对其物理及力学性质、化学组分、纤维形态四个方面的差异进行研究,旨在表型上评估ECA1和ECA2在木材质量性状上展现的非预期效应,并为转BtCry1Ac基因107杨的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验林栽植地点在衡水市枣强县林场(37.51337°N、115.72418°E),位于河北省中南部平原,年平均气温为12.9 ℃,属大陆性季风气候。年平均降水量为484.2 mm,平均无霜期为219 d,四季分明,冷暖差异大[9]。采样所在试验林营建于2015年,试验林均采用完全随机区组设计,分为5个处理,均重复3次,共15个小区,每小区30株,东西行距4 m、南北株距3 m。采用苗圃扦插繁殖的当年生苗木造林,栽植时苗高、地径基本一致,且试验地内不进行施肥除草等人工抚育。

1.2 试验材料

试验材料取自栽植于衡水市枣强县林场的转BtCry1Ac抗虫基因107杨2个株系(编号为ECA1、ECA2)及非转基因野生型株系(WT)的7年生苗木,2个转基因株系已被国家林业和草原局批准环境释放。

化学组分中抽出物测定所用材料取自3个株系的胸径处厚度5 cm的圆盘。将圆盘劈成较为均匀的木片,按照四分法取样片,放置于粉碎机中使其粉碎,然后将粉碎的样木置于40目筛进行筛选至完全通过且留于60目筛得到用于进行抽出物试验的粉末样品;测定纤维素、半纤维素、木质素所用的材料为除去抽出物后的材料。

物理及力学性质测定所用材料取自3个株系的胸径处往上1 m的木段。将圆木段锯成规定厚的木板,室内放置进行自然干燥,将木材的含水率调至12%左右,然后将木板加工成试验需要的无疵小试样进行木材物理力学性质的测定。

制备纤维形态测定的材料需采用富兰克林离析法进行木材的离析,离析后即可进行纤维形态测定。

1.3 各指标测定方法

化学组分中,纤维素与半纤维素按照GB/T 2677.10—1995测定[10],木质素按照GB/T 2677.8—1994测定[11],苯醇抽出物按照GB/T 2677.6—1994测定[12],灰分按照GB/T 742—2018测定[13],1%氢氧化钠抽出物按照GB/T 2677.5—1993测定[14]。

物理及力学性质中,冲击韧性按照GB/T 1940—2009测定[15],抗弯强度按照GB/T 1936.1—2009测定[16],抗弯弹性模量按照GB/T 1936.2—2009测定[17],顺纹抗压强度按照GB/T 1935—2009测定[18],干缩性按照GB/T 1932—2009测定[19],木材密度按照GB/T 1933—2009测定[20]。

纤维形态测定采用富兰克林离析法[21],将处理好的试验材料进行木材的离析,番红染色后置于显微镜上观察。

1.4 数据分析

采用Excel 2016进行数据处理、分析,SPSS 24.0软件进行方差分析和差异显著性检验(P<0.05),Origin2019软件绘图。

2 结果与分析

2.1 木材化学组分差异分析

由表1可知,ECA1和ECA2与WT的纤维素、灰分、苯醇抽出物及1%NaOH抽出物组分含量存在显著性差异(P<0.05),其余性质差异不显著。在ECA1和ECA2与WT的化学组分含量比较中发现,ECA1和ECA2的纤维素、灰分、苯醇抽出物及1%NaOH抽出物组分含量均明显低于WT,ECA1和ECA2的纤维素、灰分、苯醇抽出物及1%NaOH抽出物组分含量的均值分别为WT的94.41%、86.08%、87.82%、89.15%。由此可知,ECA1和ECA2与WT在化学组分含量上差异最大的为灰分,其余依次为为苯醇抽出物、1%NaOH抽出物、纤维素。

表1 不同株系107杨化学组分含量

2.2 木材力学性质差异分析

通过表2可知,ECA1和ECA2与WT在冲击韧性、抗弯强度、抗弯弹性模量和顺纹抗压强度方面存在显著性差异(P<0.05),ECA1与ECA2间无显著差异,且ECA1和ECA2的各项指标均高于WT。WT、ECA1、ECA2木材的冲击韧性分别为63.65、68.87、68.62 KJ/m2,ECA1和ECA2木材的冲击韧性比WT分别提高了7.58%、7.24%。沿木材顺纹方向施加压力,木材能承受的最大能力即为木材顺纹抗压强度,WT的顺纹抗压强度为40.83 MPa,ECA1和ECA2的顺纹抗压强度分别为44.50、43.70 MPa,两个转基因株系顺纹抗压强度较WT分别提高8.25%、6.57%。木材抗弯强度和抗弯弹性模量在木梁设计家具弯曲等方面可提供重要的参考价值,WT的抗弯强度和抗弯弹性模量分别为81.51 MPa、9 177 MPa,两个转基因株系抗弯强度和抗弯弹性模量平均值为84.97 MPa、9 556 MPa,转基因株系的抗弯强度和抗弯弹性模量分别较WT提高4.07%、3.97%。ECA1和ECA2的木材强度在总体上优于WT。

表2 不同株系107杨力学性质

2.3 木材物理性质差异分析

木材密度是木材物理性质的一个重要指标,木材密度又分为气干、全干和基本密度。ECA1和ECA2的气干密度、全干密度与WT均存在显著性差异(P<0.05);ECA2的基本密度与WT存在显著性差异(P<0.05),ECA1的基本密度与WT和ECA2无显著性差异(表3)。两个转基因株系的气干、全干和基本密度比WT的提高了3.10%、3.09%、2.63%。根据气干密度的大小又可以将木材分为很轻(<0.350 g/cm3)、轻(0.351～0.550 g/cm3)、中(0.551～0.750 g/cm3)、重(0.751～0.950 g/cm3)、很重(>0.951 g/cm3)5个等级[22]。根据气干密度大小可将3个株系的木材划分为II级(轻)。

表3 各株系物理性质

ECA1和ECA2的气干干缩和全干干缩与WT存在显著性差异(P<0.05),且均为转基因株系小于WT(表3)。ECA1与ECA2的径向气干、弦向气干、体积气干的干缩率的平均值分别为2.66%、5.53%、8.53%,WT的径向气干、弦向气干、体积气干的干缩率分别为2.89%、5.87%、9.07%,ECA1、ECA2的径向气干、弦向气干、体积气干的干缩率均值分别比WT小7.96%、5.79%、5.95%。木材干缩率是评价木材稳定性的重要指标,干缩率越小木材越不容易出现开裂等情况,说明木材更加的稳定[23]。ECA1和ECA2的气干干缩和全干干缩均小于WT,因此表明ECA1和ECA2的木材的稳定性高于WT。

2.4 木材纤维形态差异分析

通过对3个株系纤维长度进行方差分析,ECA1和ECA2与WT存在显著显异(P<0.05),表现为ECA1和ECA2小于WT,ECA1、ECA2之间纤维长度无显著性差异;WT、ECA1、ECA2三个株系的纤维宽度无显著差异(图1)。由图1a可知WT的纤维长度范围为(754.17～1 529.17) μm,ECA1和ECA2的纤维长度范围分别为(641.67～1 408.33) μm和(612.51～1 383.33) μm,可以看出WT的最短纤维长度和最长纤维长度均大于转基因株系。WT的平均纤维长度为1 166.11 μm,而ECA1纤维长度为1 021.53 μm,ECA2纤维长度为1 045.28 μm,ECA1和ECA2的纤维长度分别为WT纤维长度的87.60%、89.64%。通过图1c可得WT的纤维长宽比最高为51.23,与WT相比,转基因株系长宽比略有降低,分别为48.95、49.37。

图1 不同株系107杨纤维形态

3 讨论与结论

3.1 讨论

(1)BtCry1Ac基因的转入对107杨木材化学组分的影响

木材化学组分含量对木材材性有重要影响,是影响木材加工利用的重要因素,尤其影响其在造纸方面的应用[24]。在本研究中,纤维素、灰分、苯醇抽出物、1%NaOH抽出物含量和纤维长度差异显著,表现为ECA1和ECA2小于WT。ZHANG等[25]对11年生转BtCry1Ac基因黑杨(Populusnigra)的5个无性系进行了生长和材性性状分析,发现与非转基因株系相比,转基因株系的纤维素含量降低,木质素含量增加,与本研究结果一致。张德建等[6]以转抗虫基因741杨和非转基因741杨为研究材料,对其木材的化学组分含量进行了测定与分析,发现转基因741杨纤维素含量小于非转基因741杨,而抽出物含量变化与此相反,纤维素含量与本研究结果一致,抽出物含量与本研究结果不一致。导致该研究与本研究有差异的原因可能是不同种杨树受体转入不同的外源基因造成的,也有可能是插入位点不同或外源基因的拷贝数不同或整合时使固有基因发生了断裂、激活或沉默[26-27]。

(2)BtCry1Ac基因的转入对107杨木材物理及力学性质的影响

木材的物理及力学性质与木材稳定性、木材强度以及木材品质关系紧密[28]。对3个株系物理及力学性质的各指标进行测定发现,ECA1和ECA2的冲击韧性、抗弯强度、抗弯弹性模量、顺纹抗压强度、气干密度和全干密度均显著高于WT,说明ECA1和ECA2在外界压力下抵抗弹性变形的能力强于WT。张德建等[5]对转基因741杨木材的物理及力学性质进行测定并与非转基因741杨进行比较发现,转基因741杨的密度、力学性质均高于非转基因741杨,且全干密度、冲击韧性、抗弯强度、抗弯弹性模量和顺纹抗压强度差异显著,研究结果与本文相符。本研究中3个无性系的基本密度分布于0.35～0.41 g/cm3范围内,王嘉楠等[29]经过测定发现I-69杨不同部位的平均基本密度在0.36～0.40 g/cm3之间;于东阳等[30]以10个杨树新杂种无性系为材料进行木材的基本密度测定,发现10个无性系的整株基本密度在0.26～0.33 g/cm3之间,与本研究结果基本一致。

抗弯强度与顺纹抗压强度之和为木材综合强度值,木材综合强度与基本密度比值为木材综合品质系数。根据木材综合强度与木材综合品质系数划分标准和计算方法[22],ECA1、ECA2和WT的木材综合强度分别为129.47、128.64、122.34 MPa,均在111～170 MPa之间,属于中等强度;ECA1、ECA2和WT的木材的综合品质系数分别为298 318、294 416、289 905 Pa,均超过226 380 Pa,属于高等级材;因此,3个株系的木材综合强度属于中等强度,木材属于高等级材。木材的差异干缩为弦径向干缩率之比,一般用于评价易变形程度[31]。本研究中ECA1和ECA2与WT的差异干缩分别为2.07、2.09和2.03,均大于2,划分为大[32],说明ECA1、ECA2、WT在干燥加工中木材容易出现开裂的情况。总体而言,BtCry1Ac基因的转入使107杨的木材强度得到了提高,但木材稳定性依旧较差,在加工过程中易开裂。

(3)BtCry1Ac基因的转入对107杨纤维形态的影响

木材的纤维形态是影响造纸质量的重要因子,纤维长宽比越大,纤维就拥有更大的弹性、柔韧性、撕裂强度,形成的纸张质量就越好[33-34]。ECA1和ECA2的纤维长度、纤维宽度和纤维长宽比较WT均有不同程度的降低,其中纤维长度差异显著。朱文旭[35]对5个转多基因库安托杨(Populus×euramericana‘Guariento’)无性系和1个非转基因无性系的纤维形态进行测定后发现其中4个转基因无性系的纤维长度、纤维长宽比较非转基因株系均有不同程度的降低,与本研究结果一致。中级长度纤维的长度范围是910～1 600 μm,且长宽比高于40[36],3个株系的纤维长度和纤维长宽比均满足中级长度纤维的标准。纤维长宽比在30以下的纤维不适合造纸,长宽比大于56的纤维是优良的造纸材料[37],3个株系的纤维长宽比均在48.95以上;因此,可以认为ECA1、ECA2和WT的木材是较适合造纸的原材料,但转基因株系较差些。

3.2 结论

转入BtCry1Ac基因后,107杨木材的化学组分含量、物理和力学性质及纤维形态相关的多项相关指标较WT发生了显著的非预期性变化。转基因株系的综合强度好于野生型,属于中等强度木材,但因差异干缩值高,木材易于开裂;转基因株系纤维素、灰分含量、纤维长度、纤维宽度、纤维长宽比均低于野生型,因此与野生型相比转基因107杨表现出较低的造纸适应性。杨树为长生命周期树种,基于市场对杨树大径材的需求,应对转BtCry1Ac基因107杨大径材形成进行持续观测,为转BtCry1Ac基因杨树的生产应用提供参考。