动脉瘤性蛛网膜下腔出血患者TGF-β/Smads 信号转导通路与认知功能障碍的关系

黄 毅 ，黄永健 ，麦 玲 ，罗 婷

（1）崇左市人民医院神经外科;2）手术麻醉科;3）供给室，广西 崇左 532200）

动脉瘤性蛛网膜下腔出血（aneurysmal subarachnoid hemorrhage，aSAH）是脑血管疾病常见并发症，具有较高致残率、病死率，据相关资料显示，aSAH 病死率高达45%，约30%幸存患者中伴有不同程度的认知功能障碍，严重影响患者生命健康、生活质量[1-3]。转化生长因子β（transforming growth factor β，TGF-β）/苏氨酸激酶受体（aerinethreonine kinase receptors，Smads）信号转导通路可调控多种细胞生长分化、凋亡、周期等生物学过程，对维持机体正常发育、动态平衡具有重要作用[4-5]。既往研究显示，TGF-β1 与aSAH 发生发展密切相关，并与患者慢性脑积水形成显著有关[6]，但关于TGF-β/Smads 信号转导通路对患者认知功能障碍的研究尚未报道。本研究通过选取崇左市人民医院100 例aSAH 患者，检测患者外周血内TGF-β/Smads 信号转导通路相关因子表达，并分析其与认知功能障碍的关系，旨在为临床研究aSAH 提供参考。

1 资料与方法

1.1 临床资料

纳入标准[7]：经CT、MRI 等检查确诊aSAH；均为单个病灶；均为首次发生蛛网膜下腔出血；临床资料详细完整。排除标准：aSAH 前即存在认知功能障碍者；合并颅内占位病变；血液系统疾病；严重肝肾等功能衰竭；近1 a 内服用过认知功能障碍药物。本研究经崇左市人民医院医学伦理委员会审核批准（201802012）。

根据上述纳入、排除标准回顾性选取2018年10 月至2022 年3 月崇左市人民医院收治的100 例aSAH 患者的临床资料进行研究，其中男57 例，女43 例；年龄21～83（53.99±13.80）岁；动脉瘤大小2.5～9.3（6.48±1.43）mm；基础疾病：10 例糖尿病，26 例高血压；19 例烟酒史；Hunt-Hess 分级[8]：1～2 级86 例，3～4 级14 例；改良FISHER 分级[9]：1～2 级71 例，3～4 级29 例；动脉瘤位置：前循环87 例，后循环13 例。

1.2 认知功能障碍评估标准

出血后3 个月，由经过专业培训的神经科医师采用蒙特利尔认知评估量表（montreal cognitive assessment acale，MoCA）评估患者认知功能[10]，主要包括执行功能、记忆力、语言、视功能技能、抽象思维、注意力、计算和定向力8 个领域，总分30 分，≥26 分为正常，即无认知功能障碍（n=46）；<26 分存在认知功能障碍（n=54）。

1.3 实时荧光定量PCR 法检测TGF-β、Smad1、Smad3、Smad7 mRNA 水平

入组时，取2 组患者静脉血，与1 mL TRIzol试剂（赛默飞世尔）混合，用于抽提总RNA，检测其浓度、纯度，利用Prime Script RT 试剂盒（赛默飞世尔）合成cDNA，并以cDNA 为模板，用Premix Ex Taq 试剂盒（赛默飞世尔）于ABI 7 500 PCR 仪（赛默飞世尔）上进行扩增反应，反应体系为5.0 µL SYBR Green Mix，1.0 µL cDNA，上、下游引物各0.8 µL，ddH2O 补足至20.0 µL。采用2-ΔΔCT法计算TGF-β、Smad1、Smad3、Smad7 mRNA表达水平。引物由上海吉玛设计合成，序列见表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.4 观察指标

（1）统计2 组临床资料，包括性别、年龄、受教育年限、糖尿病、高血压、烟酒史、Hunt-Hess 分级、改良FISHER 分级、动脉瘤大小与位置、治疗方式、术后血性脑脊液引流方式及并发症发生率；（2）比较2 组患者外周血TGF-β、Smad1、Smad3、Smad7 mRNA 表达水平；（3）分析 TGF-β、Smad1、Smad3、Smad7 mRNA 与aSAH 患者认知功能障碍的关系；（4）采用受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic，ROC）分析TGF-β、Smad1、Smad3、Smad7 mRNA对aSAH 患者认知功能障碍的预测价值。

1.5 统计学处理

所有数据采用Excel 2016 收集整理，并用统计学SPSS 24.0 软件处理，计数资料用n（%）表示，χ2检验；符合正态分布的计量资料用（）表示，2 组间比较采用独立样本t检验；Logistic 进行多因素分析；采用ROC 曲线评估TGF-β、Smad1、Smad3、Smad7 mRNA 对aSAH 患者认知功能障碍的预测价值。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2 组临床资料比较

2 组性别、年龄、受教育年限、糖尿病、高血压、烟酒史、Hunt-Hess 分级、改良FISHER分级、动脉瘤大小与位置、治疗方式、术后血性脑脊液引流方式及并发症发生率比较，差异无统计学意义（P>0.05），见表2。

表2 2 组临床资料比较[（）/n（%）]（1）Tab.2 Comparison of clinical data between the two groups[（）/n（%）]（1）

表2 2 组临床资料比较[（）/n（%）]（1）Tab.2 Comparison of clinical data between the two groups[（）/n（%）]（1）

表2 2 组临床资料比较[（）/n（%）]（2）Tab.2 Comparison of clinical data between the two groups[（）/n（%）]（2）

表2 2 组临床资料比较[（）/n（%）]（1）Tab.2 Comparison of clinical data between the two groups[（）/n（%）]（1）

表2 2 组临床资料比较[（）/n（%）]（3）Tab.2 Comparison of clinical data between the two groups[（）/n（%）]（3）

表2 2 组临床资料比较[（）/n（%）]（1）Tab.2 Comparison of clinical data between the two groups[（）/n（%）]（1）

2.2 2 组TGF-β/Smads 信号转导通路相关因子表达比较

认知功能障碍组患者外周血TGF-β、Smad1、Smad3、Smad7 mRNA 表达水平较无认知功能障碍组高，差异有统计学意义（P<0.05），见表3。

表3 2 组TGF-β/Smads 信号转导通路相关因子表达比较（）Tab.3 Comparison of expression of factors related to TGF-β/Smads signaling pathway between the two groups（）

表3 2 组TGF-β/Smads 信号转导通路相关因子表达比较（）Tab.3 Comparison of expression of factors related to TGF-β/Smads signaling pathway between the two groups（）

*P <0.05。

2.3 TGF-β/Smads 信号转导通路相关因子与aSAH 患者认知功能障碍的关系

以aSAH 患者有无认知功能障碍为因变量，TGF-β、Smad1、Smad3、Smad7 mRNA 为自变量，赋值情况见表4，Logistic 回归分析显示，TGF-β、Smad1、Smad3、Smad7 mRNA 与aSAH 患者认知功能障碍独立相关（P<0.05），见表5。

表4 赋值量表Tab.4 Assignment Scale

表5 TGF-β/Smads 信号转导通路相关因子与aSAH 患者认知功能障碍的关系Tab.5 Relationship between factors related to TGF-β/Smads signaling pathway and cognitive dysfunction in patients with aSAH

2.4 TGF-β/Smads 信号转导通路相关因子预测aSAH 患者认知功能障碍的ROC 曲线

绘制TGF-β/Smads 信号转导通路相关因子预测aSAH 患者认知功能障碍的ROC 曲线，TGFβ、Smad1、Smad3、Smad7 mRNA 单独预测aSAH 患者认知功能障碍的曲线下面积（Area under the curve，AUC）值分别为0.704、0.817、0.738、0.706，联合预测AUC 为0.918，P均 <0.001，见表6、图1；进一步对各预测方案预测价值比较显示，TGF-β/Smads 信号转导通路相关因子TGFβ、Smad1、Smad3、Smad7 mRNA 联合预测的AUC 明显优于单独指标，P均 <0.05，见表7。

图1 TGF-β/Smads 信号转导通路相关因子预测aSAH患者认知功能障碍的ROC 曲线Fig.1 ROC curves of TGF-β/Smads signaling pathwayrelated factors predicting cognitive dysfunction in patients with aSAH

表7 TGF-β/Smads 信号转导通路相关因子联合与单独预测方案预测价值比较Tab.7 Comparison of predictive value of TGF-β/Smads signaling pathway-related factors in combination with separate prediction schemes

3 讨论

研究发现，aSAH 存在不同程度的认知功能障碍，其发生机制可能与脑水肿、颅内压升高、脑部缺血缺氧、脑血流灌注压降低、脑血流速度降低等有关，患者脑部组织生理病理性改变可引起海马组织微循环障碍，导致海马神经元细胞坏死、凋亡，进而影响患者认知功能[11-12]。本研究显示，100 例aSAH 患者认知功能障碍发生率为54.0%，这高于温玉东等[13]研究结果，可能与患者年龄、样本量、Hunt-Hess 分级、改良FISHER分级等有关。

研究表明，TGF-β/Smads 信号转导通路可参与中枢神经系统、脑血管等疾病发生[14-15]。TGFβ 是细胞因子超家族成员，广泛存在哺乳动物体内，目前已被发现有6 个亚型，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β1β2、TGF-β4 及TGF-β5，而各种亚型具有高度同源性，功能作用形似，可介导参与多种细胞增殖分化、凋亡、自噬、纤维化和炎症反应等[16]。TGF-β 是该信号转导通路的关键因子，可激活下游丝裂原活化蛋白激酶、细胞外信号调节激酶、磷脂酰肌醇激酶、氨基末端激酶及Smad 等因子，进而参与细胞生物学过程[17-19]。Smad 是TGF-β 下游蛋白，正常情况下TGF-β 以失活形式存在细胞质内，在一些因素刺激下（如脂多糖），神经细胞可激活TGF-β 聚合形成异四聚体，TGF-β 发生磷酸化，通过招募Smad 形成复杂的复合物进入细胞核内，从而抑制或激活目的基因转录，参与疾病发展[20]。研究显示，中枢神经细胞损伤后，可激活海马神经细胞、小胶质细胞，促进大量炎症因子生成，TGF-β1 表达增高，加重机体神经功能损伤，导致机体认知功能障碍[21]。动物研究发现，通过构建蛛网膜下腔出血大鼠模型，发现大鼠脑组织TGF-β1 蛋白表达上调，加重大鼠神经功能缺损、增加血脑屏障通透性，并促进神经细胞凋亡[22]。本研究发现，认知功能障碍组患者外周血内TGFβ mRNA 表达水平高于无认知功能障碍，且TGFβ mRNA 与aSAH 患者认知功能障碍密切相关，故笔者推测TGF-β 变化可能与aSAH 患者认知功能障碍有关，考虑其作用机制可能为外周血内TGF-β mRNA 表达水平升高，导致患者脑组织局部缺血缺氧，促进神经细胞发生炎症反应，加重神经组织损伤，进而参与aSAH 发展，但该结果仅为推测，有待临床进一步研究证实。

Smad 蛋白家族成员众多，在神经系统疾病、脑血管疾病激活TGF-β/Smads 信号转导通路，可减轻神经元细胞损伤，从而提高机体抗炎、抗凋亡作用[23-24]。研究发现，Smad3 基因缺陷帕金森病模型内，可促进炎症因子聚集在小鼠神经元细胞、星形胶质细胞，并表现出小鼠海马功能障碍[25]。本研究发现，认知功能障碍患者外周血内Smad1、Smad3、Smad7 mRNA 表现趋势与TGFβ mRNA 表现一致，表明 Smad1、Smad3、Smad7 可参与aSAH 患者认知功能障碍进展。可能是因为外周血内TGF-β mRNA 表达水平升高，激活下游Smad1、Smad3、Smad7 mRNA 表达水平，进而加重神经细胞损伤，引起患者神经功能障碍，可共同参与aSAH 发展，但具体机制尚不明确，有待进行下一步探究。

本研究通过绘制ROC 曲线，发现TGF-β/Smads 信号转导通路相关因子联合预测aSAH 患者认知功能障碍的AUC 优于单独预测，具有一定诊断效能，提示各相关因子联合预测aSAH 患者认知功能障碍的效能优于单独预测。

综上可知，aSAH 患者外周血内TGF-β/Smads信号转导通路相关因子高表达，提示该通路可能与患者认知功能障碍有关，可用于辅助临床预测aSAH 术后认知功能障碍。本研究尚存在一定局限性，仅分析该信号通路转录层面的数据，未进行蛋白、因子等分析，有待临床扩大样本量，做进一步研究证实。