猪轮状病毒G1P[7]株分离鉴定及多克隆抗体制备

李素芬，汤学超，周金柱，王丹丹，朱雪蛟，陶然，李运川，郭容利，张雪寒*，李彬*

(1. 南京农业大学动物医学院，江苏 南京 210095；2. 江苏省农业科学院兽医研究所，江苏 南京 210014)

轮状病毒(rotavirus，RV)感染与多种哺乳动物和鸟类的肠炎和腹泻有关[1]。RV是非囊膜二十面体病毒颗粒，包含11段双链 RNA基因组[1]。病毒粒子由3层病毒结构蛋白组成，VP2构成核心，VP6构成内层，VP7和VP4构成外壳，外壳包含血清型/基因型特异性表位。根据VP6蛋白的抗原性可将RV分类为12个血清群(A～L)[2-3]，A、B、C、E和H群RV已经被证实可感染猪，其中感染人和动物最常见的为A群轮状病毒(RVA)。

猪轮状病毒A群(PoRVA)感染仔猪呈世界流行，各国猪场中 PoRVA 的阳性率呈明显走高趋势，报道最高感染率可达70%以上，引起世界各国重视[4-5]，常与猪流行性腹泻病毒(PEDV)等其他腹泻病原混合感染，给世界养猪业造成严重的经济损失[6-7]。2种外衣壳蛋白(VP7和VP4)刺激中和抗体的产生，形成了RVA菌株G(糖蛋白)和P(蛋白酶敏感)双基因分型系统的基础。这种双基因分型系统通常用于RVA分类，并由轮状病毒分类工作组不断更新。根据这一分类体系，全球已描述了42种G和58种P基因型[8-9]。G/P双基因组合的多样性是免疫保护的重要决定因素，与疫苗研制高度相关[8，10]。因此，持续监测流行的RVA毒株对于了解区域流行病学信息和更新新型疫苗毒株非常重要。

小鼠EDIM毒株和猿猴SA-11毒株是能够在细胞培养中繁殖的第一批RV毒株[11-12]。牛和人源RV分别于1971年和1980年在细胞培养中首次分离出来[13-14]。本研究旨在从临床发病猪样品中分离PoRV，对分离毒株的VP4和VP7基因进行序列和遗传进化分析，为疫苗研制储备生物学材料，并且制备该分离毒株的多克隆抗体，为PoRV致病机制研究提供可靠的工具。

1 材料与方法

1.1 病料来源

从江苏省南京市附近某猪场采集腹泻猪粪便，将3份粪便与1×MEM(含双抗，其中青霉素浓度为 200 U/mL，链霉素终浓度为200 mg/mL)，按1∶3进行均质化，反复冻融2次，低温12 000 r/min离心5 min，取上清液先后使用0.45 μm和0.22 μm滤器过滤，其中吸取部分用于 RNA 提取和RT -PCR检测，剩余部分用于病毒分离。

1.2 主要试剂、细胞和动物

RNA提取试剂盒(Fast Pure Cell/Tissue Total RNA Isolation Kit V2)，HiScript Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper)和2×GreenTaqMix 预混液购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。MA104细胞由江苏省农业科学院兽医所保存。MEM和胰酶购自上海源培生物科技股份有限公司；四季青胎牛血清购自浙江天杭生物科技股份有限公司；PoRVA 的VP6单克隆抗体由本实验室制备[15]；His-sumo-VP4*P7(26～231 aa)重组蛋白由本实验室制备，是将VP4基因完整阅读框的78～693位核苷酸序列克隆到pCold-sumo质粒，大肠杆菌表达纯化所得，浓度为2 mg/mL；FITC-羊抗小鼠二抗、FITC-羊抗兔二抗和HRP-羊抗兔二抗购自武汉博士德生物科技有限公司。新西兰大白兔2只，体重3 kg/只，采购自金陵种兔场。

1.3 引物设计与合成

本研究使用引物主要用于检测PEDV、传染性胃肠炎(TGEV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)、RV、伪狂犬病毒(PRV)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)，委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成，如表1。

表1 引物信息

1.4 病原的RT-PCR检测

吸取1.1中处理的上清液样品100 μL，参照核酸提取试剂盒说明书提取总RNA和DNA。按照反转录试剂盒HiScript Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper)说明书进行反转录获得cDNA。利用2×GreenTaqMix和6种腹泻相关病毒(PEDV、TGEV、PDCoV、RV、PRV和BVDV)的检测引物进行检测。PEDV和TGEV：95 ℃预变性3 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。PDCoV：95 ℃预变性3 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。PRV：95 ℃预变性3 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。BVDV和RV-VP6：95 ℃预变性3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。

1.5 病毒分离和传代

将长满单层的MA104细胞进行消化和传代，铺1块6孔板，待细胞长满单层后接毒。首先将1.1中过滤处理上清液预处理，加入终浓度为10 μg/mL胰酶，置于37 ℃激活30 min后备用。先用1×PBS洗涤6孔板单层细胞，将前述预处理过上清液加入至6孔板中，于5% CO2培养箱中使病毒与细胞孵育1 h。之后取出6孔板，弃掉上清液，并用1×PBS洗涤2次，加入无血清、胰酶终浓度为2 μg/mL的MEM维持液，连续观察细胞病变(CPE)不少于3 d，待细胞有80% CPE时收获病毒液，反复冻融2次，收获病毒。相同的方法连续传代。

1.6 间接免疫荧光(IFA)鉴定

将MA104细胞铺于96孔板中，按照1.5方法进行病毒感染，病毒感染后24 h左右即将出现细胞病变时，弃掉上清液，用预冷的1×PBS洗涤细胞3次后加入200 μL预冷的冰乙醇，4 ℃固定30 min；再PBS洗涤3次后加入5%脱脂奶粉封闭1 h；弃掉封闭液，PBS洗涤3次之后向孔中加入50 μL稀释的PoRV VP6蛋白单克隆抗体(1∶2 500)，37 ℃孵育1 h；弃掉一抗，用PBS洗涤3次，加入50 μL稀释的FITC-羊抗小鼠二抗(1∶2 000)，37 ℃孵育45 min；弃掉二抗，用PBS洗涤3次，显微镜下观察并拍照。

1.7 VP4和VP7基因扩增和序列分析

RV-VP4-F和RV-VP4-R、RV-VP7-F和RV-VP7-R扩增VP4和VP7基因片段，反应程序为：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 10 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min。扩增产物送南京擎科生物科技有限公司进行测序。利用生物信息学软件DNAStar对VP4(表2)和VP7(表3)基因与NCBI中的G基因型和P基因型代表毒株序列进行核苷酸同源性分析和遗传进化分析。

表2 RV P[7](VP4基因)参考序列信息

表3 RV G1(VP7基因)参考序列信息

1.8 兔源多克隆抗体制备和效价测定

将灭活剂β-丙内酯按照0.05%比例加入到PoRV(TCID50=106/mL)病毒液中，充分混匀后4 ℃灭活24 h，经灭活检验合格后，与MONTANIDETM ISA 201VG佐剂按照1∶1混合乳化制备的免疫原，背部皮下注射新西兰大白兔，1 mL/只。共免疫3次，首免和2次加强免疫之间分别间隔21 d，分别于免疫前和免疫后耳静脉采血测定抗体效价。

采用中和抗体方法测定抗体效价。首先将200 TCID50的病毒液与10倍比稀释的兔血清等体积混合，放37 ℃孵育1 h，然后加入到长满单层MA104的96孔板中，5% CO2培养箱中继续孵育1 h。然后弃掉病毒血清混合液后，加入含有终浓度为2 μg/mL胰酶的病毒维持液(MEM)，继续培养。同时设置免疫前血清对照，所有试验孔和对照孔都设置3个重复。每日观察并统计细胞病变情况，计算中和效价。

1.9 兔源多克隆抗体的反应性鉴定

Western blot和IFA对多克隆抗体反应性鉴定。IFA参照1.6方法操作，将PoRV VP6单克隆抗体替换为兔源多克隆抗体(1∶10 000)，替换使用FITC-羊抗兔荧光二抗(1∶2 000)，其他操作相同，显微镜下观察并拍照。

Western blot检测方法：吸取实验室保存的P7血清型重组蛋白His-sumo-VP4*P7，10 μL，按照1/5(体积比)加入5×上样缓冲液，震荡混匀加热处理10 min后，上样进行SDS-PAGE分析，然后使用半干式转印仪进行免疫印迹操作。转印结束，使用5%脱脂乳封闭醋酸纤维(NC)膜，洗涤后加入兔源多克隆抗体(1∶20 000)，室温孵育2 h，弃掉一抗，用PBS洗涤3次，加入稀释的HRP-羊抗兔二抗(1∶10 000)，室温孵育1 h；弃掉二抗并洗涤后，ECL方法曝光显色并拍照。

2 结果

2.1 腹泻相关病原的检测

将腹泻样品提取RNA，RT-PCR分别检测RV、PEDV、TGEV、PDCoV、PRV和BVDV，只有RV-VP6引物成功扩增出长度为309 bp的条带(图1)，而PEDV、TGEV、PDCoV和BVDV核酸全为阴性。提取腹泻样品DNA，PCR扩增PRV，也呈现阴性扩增。扩增6种病毒阳性对照全部成立。

M．DL2000 分子量标准；1.RV；2.PEDV；3.TGEV；4.PDCoV；5～6.RV阴性对照；7.RV阳性对照；8～10.分别为PEDV、TGEV和PDCoV阳性对照；11.PRV阳性对照；12.PRV阴性对照；13.PRV；14.BVDV阳性对照；15.BVDV阴性对照；16.BVDV。

2.2 病毒分离、鉴定和传代培养

将RV阳性滤液接种单层MA104细胞，初次接种48 h后，显微镜下即可观察到融合、圆缩，最后瓦解脱落的CPE。按照相同方法传至第5代，VP6基因检测均为阳性，且都可以产生明显CPE。通过IFA检测，感染细胞呈现RV VP6蛋白特异性荧光(图2)，表明成功分离到RV，将其命名为JSNJ2019株。新分离病毒适应细胞需传代以提高病毒滴度。将JSNJ2019在MA104细胞上连续传到第11代(P11)，并分别测定半数组织细胞感染量(TCID50)，病毒滴度从P8到P11逐步升高，介于105～106.5TCID50/mL(图3)。

图2 PoRV接种MA104细胞出现的病变

图3 PoRV JSNJ2019不同代次滴度

2.3 VP4和VP7基因扩增、序列同源性和遗传进化分析

VP4基因决定PoRV的P基因型，设计引物采用RT-PCR扩增出特异性条带，测序后序列比较确定为P[7]基因型。利用DNAStar软件对7株P[7]基因型的PoRV的VP4基因进行序列相似性比对分析，发现本试验分离毒株JSNJ2019株与参考毒株的PoRV VP4基因核苷酸相似性为91.8%～99.8%(图4)。使用DNAStar软件中的Clustal W方法对7个NCBI数据库来源和JSNJ2019株的VP4基因序列进行比对分析，并构建遗传进化树(图5)，发现JSNJ2019株单独形成1个进化分支，介于猪源与牛源之间的分支。

注：◀为本研究分离株，下同。

图5 VP4基因遗传进化分析

VP7基因是决定PoRV的G基因型，设计引物采用RT-PCR扩增出特异性条带，测序后序列比较确定为G1基因型。利用DNAStar软件对7株G1基因型PoRV的VP7基因进行序列相似性比对分析，发现本试验分离毒株JSNJ2019株与参考毒株的PoRV VP7基因核苷酸相似性为96.3%～99.6%(图6)。使用DNAStar软件中的Clustal W方法对7个NCBI数据库来源和JSNJ2019株的VP7基因序列进行比对分析，并构建遗传进化树(图7)，发现JSNJ2019株与熊猫源的在同一进化分支。

图6 VP7基因同源性分析

图7 VP7基因遗传进化分析

综上，确定JSNJ2019毒株基因型是G1P[7]。

2.4 高免血清制备和检测

以JSNJ2019全病毒灭活苗为免疫原制备的抗血清，2倍比稀释后测定中和JSNJ2019的能力，3次免疫后中和抗体效价最高可达211(图8A)。同时取JSNJ2019第10代病毒接种单层MA104细胞，进行IFA检测，镜下可见明显的绿色荧光(图8B)。Western blot检测显示，只有PoRV重组蛋白His-sumo-VP8*P[7]出现特异性条带，分子量38 kDa(图8C)。

注：C图中M为预染中分子量标准，1为His-sumo标签蛋白，2～3为His-sumo-VP4*P[7]。

3 讨论

PoRV是呼肠孤病毒科轮状病毒属的成员。到目前为止，国内外流行病学数据显示PoRV的感染率逐年升高，而且A群PoRV是猪场绝对优势的流行血清群[18-19]。PoRVA主要感染新生仔猪肠上皮细胞，多与PEDV等猪腹泻病原混合感染而加重猪腹泻，甚至死亡[20]，粪便是腹泻相关病原的主要传播介质，通过粪-口和接触传播方式感染其他猪[21]。本研究采集腹泻猪新鲜粪便，首先通过RT-PCR鉴别检测，只有PoRV为阳性扩增且条带特异，经测序分析进一步明确VP6基因型为A群PoRV。

VP7和VP4蛋白决定PoRV的G型与P型以及它的毒力[2]。G/P型之间会产生不同的组合，不同组合型的PoRVA毒株诱导的交叉保护性低[22-23]。因此，加强不同G/P型的监测和毒株分离对系统了解PoRVA的遗传进化和研发时效疫苗非常重要。本研究中从腹泻猪粪便中检测到G1和P[7]的组合基因型，成功分离到毒株，并可以稳定传代，国内鲜见报道从猪体分离到猪源G1P[7]型，丰富了国内PoRVA的资料，有利于对国内RVA的监测。VP4基因序列遗传进化分析发现JSNJ2019株单独形成1个进化分支，介于猪源与牛源之间的分支；VP7基因序列遗传进化进一步发现，JSNJ2019株与我国2009年报道分离的熊猫来源的CH-1毒株在同一个进化分支。由此可见，PoRVA不同G/P基因型组合具有明显的多样性和复杂性，对有效防控PoRVA的流行和感染具有很大的挑战。

综上，通过对南京附近猪腹泻样本主要流行腹泻病原的检测，发现仅PoRVA为阳性，通过系列分型检测和序列分析，首次鉴定G1P[7]基因型组合在猪群的流行；进一步采用敏感细胞系传代培养和血清学鉴定成功分离得到G1P[7]型毒株JSNJ2019，并制备了高滴度的兔源多克隆抗体，表现出优秀的免疫原性。因此，本研究丰富了PoRV流行病学数据，并为时效疫苗的研制奠定了物质基础。