杭州地区牛乳源大肠杆菌的分离鉴定及木糖醇联用抗菌肽对生物被膜形成的干预

赖文韬，余茂林，姜中其

(浙江大学动物科学学院，浙江 杭州 310058)

大肠杆菌(Escherichiacoli)是一种常见的奶牛乳房炎病原体，可导致奶牛产奶量减少、乳品质下降以及提高淘汰率、死亡率。该菌主要的毒力因子脂多糖(LPS)可以引发内毒素休克和免疫反应，促进炎症因子的表达并影响抗菌药物的功效[1]。此外，大肠杆菌通过形成生物被膜(BBF)加强了对宿主免疫系统和抗菌药物的耐受性[2]。因此，研究新的治疗办法十分必要。

木糖醇是一种天然的五碳糖醇，具有许多优良的特性，包括能够替代蔗糖作为天然的甜味剂以及防止龋齿等[3]。在畜牧业中，木糖醇可用于治疗奶牛酮病[4-5]，促进免疫应激状态下肉鸡生长[6-7]等。有研究显示，木糖醇能够抑制许多病原菌的生长和附着，如大肠杆菌、链球菌、金黄色葡萄球菌和沙门菌等[8]，不仅能干预生物被膜的形成，而且也能破坏已经成熟的生物被膜[9]。抗菌肽(AMPs)是一种小分子多肽类生物活性物质，是宿主先天性免疫防御系统的重要组成部分。抗菌肽带正电荷，能够与LPS静电结合并破坏细胞膜的完整性。研究表明，某些抗菌肽具有抗生物被膜的特性，能够破坏生物被膜并防止其形成。抗菌肽带正电荷，能够与脂多糖静电结合并破坏细胞膜的完整性[10]。通过比较一系列具有抗BBF活性的AMPs，筛选出抗菌肽1037(KRFRIRVRV)，研究表明，其抗BBF活性最强，在低浓度(1/2 MIC)下，能使BBF形成减少78%[11]。

本试验分析木糖醇联用抗菌肽1037对大肠杆菌生物被膜最小抑菌浓度(MBIC)和最小杀菌浓度(MBEC)的影响，并进一步探究2种药物联合应用对大肠杆菌生物被膜的作用。研究结果可为临床治疗大肠杆菌引起的奶牛乳房炎及耐药性的控制提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂

木糖醇(USP grade，批号：XB0997)，生工生物工程(上海)股份有限公司；抗菌肽1037(氨基酸序列为：KRFRIRVRV，通过标准固相方法合成，反相高效液相层析检测纯度均为99%以上)，吉尔生化生物科技有限公司；血琼脂平板、刚果红、结晶紫，生工生物工程(上海)股份有限公司；Luria-Bertani(LB)肉汤培养基、Nutrient Broth(NB)琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、肠杆菌科细菌生化试验管，杭州滨河微生物试剂有限公司；乙醇、戊二醛、锇酸，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 主要仪器设备

卡尔加里生物被膜发生装置，光景生物科技(苏州)有限公司；聚氯乙烯(PVC)薄片，迎佳橡胶绝缘材料厂；ZEISS Gemini SEM 300场发射扫描电子显微镜，卡尔蔡司(上海)管理有限公司；Hitachi HCP-2型临界点干燥仪，日本日立公司。

1.3 菌株分离鉴定

采集杭州地区近江、富伦、正兴等6个规模较大的奶牛场奶样共200份，划线接种于血琼脂平板，37 ℃培养24 h，再挑取单菌落至麦康凯平板，37 ℃培养24 h；挑取麦康凯平板上的单菌落革兰染色后镜检，同时进行生化试验。之后采用PCR法鉴定大肠杆菌，根据文献报道的PCR引物[12]，引物序列为F：5′-ATCAACCGAGATTCCCCCAGT-3′，R：5′-TCACTATCGGTCAGTCAGGAG-3′，扩增目标条带232 bp，引物由生工生物工程有限公司(上海)股份有限公司合成。

1.4 药液配制

取抗菌肽溶于无菌去离子水，配制成4 098 μg/mL的储备液；取木糖醇溶于LB肉汤，配制成5%的储备液，121 ℃高温高压灭菌后冷却备用。

1.5 菌悬液制备

将大肠杆菌接种于LB液体培养基，37 ℃振荡培养12 h，调整浓度为0.5个麦氏浊度，作为生物被膜待接种菌悬液备用。

1.6 生物被膜形成能力的测定

1.6.1 刚果红(CRA)定性检测

将菌悬液划线接种于刚果红琼脂平板37 ℃培养24 h，置室温72 h，观察菌落的颜色和形态。粗糙、干燥、水晶样的黑色菌落判定为被膜阳性菌株；红色光滑型菌落为生物被膜阴性菌株。

1.6.2 结晶紫(SQAA)半定量检测

将菌悬液加入卡尔加里生物被膜发生装置平板的孔中，以LB肉汤为阴性对照，37 ℃培养48 h；将平板中液体移除，无菌生理盐水充分漂洗除去浮游菌，室温干燥后用95%乙醇固定5 min；再用1%结晶紫染色5 min；用灭菌生理盐水漂洗除去剩余的染液；再用35%乙醇脱色30 min，释放钉柱板上生物被膜中的结晶紫；测定570 nm波长处的吸光值。重复3次，OD值取3组平均值。OD570 nm≥0.1的为生物被膜阳性菌株，OD570 nm<0.1的为生物被膜阴性菌株。

1.7 MBIC的测定

选择CRA与SQAA检测中均呈现生物被膜阳性的大肠杆菌临床分离株ZX-45，参考虞惠贞[9]的方法，进行MBIC、MBEC的测定以及药物干预生物被膜试验。

2个月规培结束后,对PBL组及SBME-PBL组学员进行理论知识与实践成绩考核,实践考核主要包括病例分析与神经系统检查结果的评估。并由学员填写问卷调查表,问卷内容包括是否有助于提高自学能力、学习兴趣、临床思维能力、知识的系统性掌握、临床实践的适应操作能力、基础知识的掌握、团队协作能力等。各项调查回答为同意或不同意,两组问卷结果以百分比形式呈现。

①取生物被膜待接种菌液，200 μL/孔加入MBEC发生装置板的96孔里，共加入2排，盖上钉柱盖，37 ℃静置培养24 h，培养生物被膜；②弃去培养液，用无菌生理盐水小心冲洗钉柱盖的钉子，除去浮游菌；③另取1块新的MBEC发生装置板，第1排每孔加入100 μL无菌LB培养基，取100 μL抗菌肽加入第1孔，混合均匀后，连续2倍倍比稀释至第12孔，使每孔抗菌肽浓度为1～2 048 μg/mL；第2排孔加入100 μL无菌5%木糖醇-LB培养基，取100 μL抗菌肽同法稀释，使每孔抗菌肽浓度为1～2 048 μg/mL；④将冲洗好的钉柱盖盖到加有药品的MBEC发生装置板上，37 ℃静置培养24 h；⑤肉眼观察MBEC发生装置板，培养液澄清无菌生长的孔最低稀释度药物浓度为MBIC。

1.8 MBEC的测定

从MBEC板上表现澄清未长菌的孔里，每孔吸取100 μL培养液涂于NB琼脂培养基上，37 ℃培养24 h，平板菌落数小于5的最低稀释度作为MBEC。

1.9 木糖醇和抗菌肽对成熟大肠杆菌干预的扫描电镜观察

1.9.1 生物被膜的培养

①取12孔细胞培养板，放入PVC；②取3 mL大肠杆菌菌悬液加入4孔，另外1孔加入3 mL无菌LB液体培养基，37 ℃培养24 h；③另取1块新的12孔细胞培养板，分别向对应孔里加入3 mL无菌液体LB培养基，3 mL 5%木糖醇-LB培养基，3 mL抗菌肽-LB培养基(浓度为MBIC)，3 mL抗菌肽-5%木糖醇LB培养基(浓度为MBIC)；④将步骤②中培养的PVC薄片用无菌镊子取出，生理盐水冲洗正反面，然后正面朝上，放入步骤③中加有新培养基的12孔细胞培养板里，将步骤②中加无菌液体培养基作对照培养的PVC板放入步骤③的无菌液体培养基中，37 ℃，培养24 h。

1.9.2 扫描电镜观察的前处理

取1块新的96孔板，每孔加入3 mL 2.5%戊二醛；取出PVC薄片，正面朝上，放入戊二醛里，4 ℃，过夜固定；按扫描电镜要求进行处理后，在Hitachi HCP-2型临界点干燥仪中进行干燥、镀膜，最后在ZEISS Gemini SEM 300场发射扫描电子显微镜观察。

2 结果

2.1 细菌分离鉴定

从200份乳房炎奶样中共分离出303株细菌，经麦康凯培养基选择性培养、革兰染色、生化试验以及PCR，鉴定出大肠杆菌98株。麦康凯培养基上分离出的菌落边缘整体成圆形、粉红色(图1)；革兰染色镜检呈两端钝圆、散在或成对存在、红色的革兰阴性直短杆菌(图2)；生化试验结果见表1，除尿素、苯丙氨酸、枸橼酸盐及硫化氢呈阴性外，其余均呈阳性，符合大肠杆菌生化特性；PCR产物的琼脂糖凝胶电泳见图3，阳性对照和所有临床分离株均扩增出232 bp的目标条带，而阴性对照未见任何条带。

表1 分离菌株生化特性鉴定结果

图1 分离菌落形态(麦康凯琼脂平板)

图2 革兰染色镜检形态(400×)

M.DNA标准DL1000；1. 阴性对照；2. 阳性对照；3～6. 分离菌株。

2.2 大肠杆菌生物被膜形成能力的测定

大肠杆菌生物被膜形成能力测定结果如图4所示，根据刚果红平板观察(图5)，98株临床分离株中，生物被膜阳性菌株有57株，生物被膜阴性菌株有41株。根据OD570 nm测定结果，生物被膜阳性菌株有67株，生物被膜阴性菌株有31株。

图4 大肠杆菌生物被膜形成能力

A.生物被膜阳性菌株；B.生物被膜阴性菌株。

2.3 木糖醇和抗菌肽对成熟大肠杆菌生物被膜的MBIC和MBEC

抗菌肽1037对大肠杆菌生物被膜单独作用的MBIC和MBEC相对较高，但是结合5%木糖醇以后，其MBIC和MBEC都明显降低。

2.4 木糖醇和抗菌肽对成熟大肠杆菌生物被膜干预的扫描电镜观察

通过图6的观察可知，空白对照组中的大肠杆菌数量较多，且表面覆盖了黏稠的膜状物，提示其形成了明显的生物被膜。在5%木糖醇处理组中，在低倍镜下可见大肠杆菌数量有轻微减少，高倍镜下见菌体表面的膜状物较空白对照组稍薄，菌体间呈现出丝状连接的特点。在抗菌肽处理组中，细菌数量较空白对照组和5%木糖醇处理组明显减少，且菌体的短杆形态基本正常，表面没有黏稠的生物被膜覆盖，菌体间呈现出丝状连接的特点，甚至可见部分被破坏的菌体。在5%木糖醇联用抗菌肽处理组中，细菌数量较空白对照组和5%木糖醇处理组明显减少，表面没有黏稠的生物被膜覆盖，丝状连接较抗菌肽处理组明显减少，菌体变形严重，呈现出短球状、长杆状、杆状等不同形态，且可见裂解的菌体碎片。

图6 大肠杆菌生物被膜扫描电镜观察

综上可以得出以下结论：木糖醇和抗菌肽联用能够减少大肠杆菌的数量并破坏生物被膜的形成，其中抗菌肽能够更有效地抑制大肠杆菌的数量，并且能够破坏菌体表面的生物被膜。同时，联用处理还可能导致大肠杆菌菌体的形态变化和菌体碎片的产生。

3 讨论

大肠杆菌广泛存在于奶牛的体表和环境中，是引起奶牛乳房炎的主要环境性致病菌。在早先的研究中，Yu等[13]收集了我国4个地区的750份来自乳房炎病例的牛源奶样，大肠杆菌分离率为11.1%。廖智慧等[14]报道，衡水地区乳源大肠杆菌的分离率为33.3%，而本研究发现杭州地区的乳源大肠杆菌分离率高达49%，高于之前的报道。此外，我们还发现大肠杆菌在杭州地区的奶牛群体中的流行率为32.2%，高于陕西省西安、杨凌、宝鸡和咸阳地区的流行率(15.8%)[15]，但低于河北规模化奶牛场的流行率(64.28%)[16]。李芬等[17]从患乳房炎的牛奶样中分离的35株大肠杆菌发现，BBF阳性率为54.29%，本试验测得临床分离的大肠杆菌中有58.2%为BBF阳性菌株，与该报道结果接近。此次研究对大肠杆菌的流行情况以及BBF形成能力进行了更深入地了解。

近年来，细菌性奶牛乳房炎治疗越来越困难，细菌耐药性的产生是主要原因之一，而BBF形成又为细菌的生存提供了一层保障，为疾病的治疗增加了难度。抗菌肽是宿主先天性免疫防御系统产生的一类抵抗外界病原体感染的小分子多肽类生物活性物质，具有一定的抗菌作用以及抗生物被膜作用[18-20]。天然抗菌肽通常是由12～60个氨基酸组成的小分子阳离子多肽[21]，Fuente-Núez等[11]发现一系列具有抗BBF活性的抗菌肽，一级结构中均有序列(FRIRVRV)，以此为基础合成了仅由9个氨基酸组成的抗菌肽1037(KRFRIRVRV)，在保持其抗BBF活性的情况下，尽量减少了肽的大小，研究显示，抗菌肽1037能显著减少革兰阴性(铜绿假单胞菌、洋葱伯克霍尔德菌)和革兰阳性(李斯特菌)细菌BBF形成。本研究表明，抗菌肽1037能明显减少大肠杆菌BBF形成，体现出的抗BBF作用与以上结果相一致，抗菌肽1037与其他具有抗菌特性的药物联用有一定的开发前景。

此外，本研究发现5%木糖醇联用抗菌肽1037在降低大肠杆菌对抗菌肽1037耐药性方面具有协同作用。与单独使用抗菌肽1037相比，联用后的抗菌效果明显增强，菌体的丝状连接更少，菌体严重变形甚至破裂，呈现出短球状、长杆状、杆状等不同形态。虞惠贞[9]研究发现，5%木糖醇联用环丙沙星和恩诺沙星后，同样可以显著降低抗菌药物MBIC以及MBEC。有研究指出，木糖醇可以扩散到BBF内部，积累形成一种有毒的非代谢糖醇磷酸，从而抑制细菌生长或者BBF中应激蛋白的产生，表现出明显的抗BBF活性[22-24]。由于抗菌肽作用方式与常规抗生素不同，其靶向细菌膜，产生膜不稳定或形成穿膜孔，最终导致细胞破裂[25]。因此，在联用抗生素时，抗菌肽1037有可能促进抗生素进入细菌细胞，增强其杀菌效果。如宁亚维等[26]研究发现，抗菌肽brevilaterin与柠檬酸可通过破环细胞膜的完整性与降解菌体DNA以发挥协同抑制大肠杆菌的作用。

总之，本研究发现大肠杆菌在杭州地区奶牛乳房炎病例中分离率和BBF阳性率较高，抗菌肽1037能够明显减少大肠杆菌对生物被膜的形成，而5%木糖醇能够协同增强抗菌肽1037对细菌的杀菌作用并破坏已形成的生物被膜。联用抗菌肽和木糖醇或其他抗生素，有望用于临床上大肠杆菌引起的奶牛乳房炎治疗及生物被膜的清除。此外，抗菌肽1037是否通过破坏细菌细胞膜为木糖醇进入细菌创造了条件，值得进一步深入研究。