非转基因法阿尔兹海默病动物模型的研究进展

吴殿秀，韩雨霖，袁依然，周姝婷，王海鹏 （北华大学基础医学院，吉林 吉林 132013）

阿尔兹海默病（Alzheimer's disease，AD）即老年痴呆症，是一种中枢神经退行性病变。据世卫组织报道，目前有5500 万人患有痴呆症。在我国60 岁及以上老年人中有9.83 万人患有阿尔茨海默病[1]。有学者推断，到2050 年我国阿尔茨海默病患者将达到3003 万人。随着我国人口老龄化的发展进程，可以预见AD 将严重威胁老年人的生活质量和健康状况，所以对AD 治疗方法的研究迫在眉睫。笔者在检索AD 造模相关文献时发现，多数文献来自国外，国内对于AD 模型的研究较少。所以本文充分比较不同AD 动物模型的优缺点，为科学研究者针对不同的实验内容选取不同的动物模型提供确切的理论依据。

1 单点或多点注射β-淀粉样蛋白寡聚体

注射点选择在AD 主要发生病变的，且与记忆和学习息息相关的小鼠海马的CA1 区和齿状回区。注射物为β-淀粉样蛋白（amyloid β-protein，Aβ）1-42和Aβ25-23形成的寡聚体。此模型最早在第7 天时出现氧化应激，神经元死亡以及突触可塑性降低等病理变化，但由于未形成斑块且其他病理特征较轻微，行为学特征不够明显故不能作为模型使用。该模型到2月龄时出现稳定的神经元丢失和淀粉样沉积[2]。该造模方法有许多缺陷，首先注射手法和位置的选择极其重要，容易伤及脑组织。其次通过注射带来的病理学特征较为局限，病理特征仅局限于注射区，但对于某些药物对单一区域影响的研究有较大价值。与此同时，关于AD 的发病机制，Aβ 沉积是否为关键环节还有待商榷，有研究显示清除Aβ 斑块并不会改善AD 患者的行为、认知等障碍，并且在无AD 老人脑中也会有Aβ 沉积。但这种造模方式也常用于诱导AD 动物模型联合其他转基因以及非转基因方法造模。

2 Tau蛋白相关病理模型

注射蛋白有人工合成Tau 蛋白纤维和人源Tau蛋白两种。微管相关蛋白Tau 是由6 种异构体组成的家族，在AD 患者脑内发生神经退行性变的神经元中异常过度磷酸化并积聚，正常Tau 与AD 过度磷酸化Tau（ADP-Tau）的亚型有特异性相互作用，其中Tau4L 与其结合能力最强[3]。从AD 脑中获得的不溶性组分接种Tau 后，宿主Tau 对于注射Tau 的播种和扩散是强制性的，且Tau的播种和扩散是可变的基因型依赖的Tau 磷酸化和Tau 硝基化，MAP2 磷酸化和与异常Tau 沉积共定位的激酶的可变激活。在Tau的体外研究中显示纤维性Tau 病理形成之前存在替代的Tau 聚集体，这些Tau 的分层寡聚形式也有助于神经变性[4]。Tau 注射时，由于小鼠本身含有的宿主Tau和注射区域的差异，对损伤的细胞以及产生沉积物的分子组成，均会产生影响。越来越多的证据表明，Tau 聚集物以朊病毒样的方式传播和复制，伴随着病理性Tau 种子的摄取，导致受体细胞中单体Tau的错误折叠和聚集。国外的研究者将离心与洗脱法相结合，从AD脑内提取出Tau聚集物，并将该物质注射到小鼠的海马和皮质区，3月龄时即在注射区检测到磷酸化Tau蛋白，并且病理变化随时间呈进行性发展[5]。在与人源Tau 相结合的和与人工Tau（Tau-磷脂复合物寡聚体）相结合的转基因小鼠的比较中发现，人源Tau 蛋白模型会显现出更加明显的病理特征[6]。但人源AD 的获取复杂困难，且人工Tau 寡聚体注射后在2 月龄时即可出现典型的Tau 聚集和小鼠功能认知障碍，故人工Tau寡聚体注射的造模方法常单用或者与转基因方法以及其他非转基因方法联用，以研究AD 的病理机制以及各种类型的药物作用筛选。

3 神经炎症相关模型

3.1 侧脑室和脑内注射链脲佐菌素

炎症有助于机体的自身防御，但在脑神经细胞中长期的炎症则会造成神经炎症。在中枢神经系统中主要是小胶质细胞释放大量炎症因子促发慢性炎症，造成神经组织的损伤，参加神经退行性疾病的发生。同时促炎因子也可以促进Aβ 斑块的沉积和Tau磷酸化[7]。

侧脑室注射链脲佐菌素（Streptozocin，STZ）诱导的脑状态是一种广泛使用的散发性阿尔茨海默病（sAD）模型。注射后3 个月观察到背侧海马内神经元丢失，激活了神经炎症，胆碱能传递不足，谷胱甘肽水平降低[8]。STZ处理的大鼠在21 d时空间学习和识别记忆、社会认知和视觉记忆中表现出显著损伤。研究显示实验结果与STZ 剂量的应用和食物的摄入有关，故还需进一步研究加强明确造模方法[9]。在AD 患者分子病理中，以胰岛素抵抗脑状态和脑葡萄糖代谢改变为表现的中枢代谢功能障碍最近受到关注。胰岛素抵抗脑状态现被认为是一种常见的潜在代谢病理和神经退行性过程的贡献者，而不是特定的神经退行性疾病的直接原因[10]。sAD 被认为与脑内胰岛素受体信号受损有关。使用β 细胞毒性药物STZ进行侧脑室注射后，模型大鼠出现胰岛素抵抗的大脑状态[11]。故该模型也常用于胰岛素信号与AD在大脑中联系的研究。但该模型具有局限性，在造模过程中发现，雄性大鼠对于STZ 的敏感性高于雌性大鼠，这与AD 女性多与男性的发病相悖，目前尚不清楚哪些变化是由于性类固醇调节引起的[12]。

3.2 侧脑室和脑内注射脂多糖

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）又叫内毒素，是革兰阴性菌细胞壁的组成成分。慢性脂多糖处理诱导的系统性炎症导致转基因AD 小鼠模型脑内脂代谢异常，与cPLA2 活性的潜在变化有关。其表现为区分功能障碍，但对空间记忆没有影响[13]。而长期LPS 刺激可导致记忆和学习障碍[14]。不同年龄的大鼠对于LPS 的敏感度即神经炎性反应也不同，其中最敏感的为老龄组大鼠（23 月龄），其表现为产生γ干扰素[15]。该方法通常与转基因方法联用，加重AD病理表现，缩短造模时间。

4 腺相关病毒模型

脑定位注射腺相关病毒。腺相关病毒是一种不依赖于包膜的细小DNA病毒。该模型病理检测发现大鼠出现突触损伤、Aβ 沉积以及神经炎等病理特征，显著损害了空间记忆和长期记忆。在体外实验中可以发现Aβ 能诱导星形胶质细胞中GluN2A 显著增加[16]。该成果迅速运用到腺相关病毒模型的制作中，给小鼠脑内输入含有星型胶质细胞特异性启动子的GluN2AA-shRNA 腺相关病毒，结果显示这一操作加重了小鼠的空间行为认知障碍。该造模方法简单易操作且造模时间短，但无可避免的会对脑组织造成一定伤害。若通过静脉注射，黏膜给药等方法，由于血脑屏障的存在，会减少入脑病毒的浓度。该方法亦可用在转基因AD 模型小鼠中，以加快造模进程。

5 衰老相关模型

制作方法为腹腔或皮下注射D-半乳糖，连续90 d，通过激活氧化应激反应，加重神经炎性反应，影响线粒体功能促进细胞凋亡等制备衰老AD 模型。90 d 后小鼠的学习记忆能力显著下降，脑组织氧化还原酶等下降，脑细胞萎缩凋亡[17]。此法也可以同时注射亚硝酸钠，使血红蛋白变成高铁血红蛋白，失去携氧能力，加重多器官缺血缺氧，加快造模进程。该方法常与其他转基因或非转基因办法同时应用，诱发或加重AD 相关病理表现。此方法若单独使用局限性较大，其造模时间长，且不具备典型的AD 病理特征，并且不同品种，不同年龄小鼠对D-半乳糖敏感程度不同，其造模时间与病理检测时间相对不好制定。近些年有研究证明小剂量的D-半乳糖或可增强小鼠的空间记忆学习能力，且有研究表明短期的（小于8 周）的给药未造成小鼠类似AD 的病理表现[18]，故据此得出结论D-半乳糖的给药时间以及剂量的确定对于造模非常重要。

6 饮食及环境相关模型

无论是在模型的制作中还是在人AD 的发病诱因中，都不可忽视饮食和环境的因素。长期高糖、高脂、高盐饮食会增加患AD 的风险。但在近期研究中给AD 患者使用降胆固醇他汀类药物并不能有效延缓或是缓解AD 的发病进程，且高胆固醇饮食模型脑内Aβ 沉积以及脑萎缩现象均不明显[19]。也有研究显示，胆固醇调节基因变异会增加AD 的患病风险，故使用高胆固醇饲喂方法对于AD 的造模还有很大的争议。郭琳等[20]给予小鼠吸入可吸入颗粒物PM10，实验结果显示，小鼠大脑皮层有助于记忆功能的NR2B 蛋白的表达与PM10的暴露浓度呈正相关，且大鼠海马区神经元突触减少，突触前突触小泡增多，突触后致密物增厚也与PM10暴露浓度呈正相关，即可吸入颗粒造成神经功能损伤。刘颖等[21]给予小鼠吸入大气颗粒物，并同时进行高质高糖饲喂，结果3 个月后实验小鼠即出现空间记忆损伤，且随时间损伤程度逐渐增加，该试验方法有效的降低了实验鼠的学习记忆能力。国外学者用2%~3.8%的甲醛溶液饲喂小鼠，10 d 后造成小鼠空间记忆受损，海马体萎缩，Tau 蛋白磷酸化水平升高，但无Aβ 斑块沉积[22]。还有学者研究了丙烯醛处理小鼠，导致小鼠在一月龄时即出现AD 的经典病变和嗅觉障碍，丙烯醛模型小鼠突触损伤和神经炎症的原因可能是激活海马RhoA/ROCK2/p-cofilin 相关通路[23]。应用兴奋性毒素如鹅膏蕈氨酸、奎司奎酸、红藻氨酸等，也可一定程度上引发AD 样病理表现。但由于产生Aβ 斑块能力不稳定，Tau磷酸化程度参差不齐故对于病理特点的研究意义不大，常联合其他造模方法同时使用，缩短造模时间。

7 冈田酸诱导模型

冈田酸（okadaic acid，OA）也叫软海绵酸，是腹泻型贝毒的一种。OA 有神经毒性，影响海马神经递质的活性，使Tau 蛋白过度磷酸化形成神经纤维缠结，从而导致严重的记忆障碍。通过脑内注射和鼻腔给药两种方法，常与缺氧方法联用[24]。吴敏霞等[25]研究显示，模型小鼠在Morris水迷宫和逃避与潜伏实验中产生明显的空间记忆障碍，且小鼠脑内产生明显的神经纤维缠结和Tau过磷酸化现象。是制作研究AD病理特征，治疗方法的良好模型。但此法也不可避免地损伤部分脑细胞，且对于OA 的最佳给药时间和频次相关研究较少，还需继续研究探索。

8 金属离子紊乱相关模型

AD 的组织病理学特征是细胞内的神经纤维缠结和细胞外由Aβ 与铜、铁或锌等金属离子聚集形成的老年斑。当与Aβ 结合时，氧化还原活性金属离子。如铜可以催化产生活性氧，尤其是反应活性最强的羟基自由基，可能对Aβ 肽本身及周围分子造成氧化损伤[26]。有学者成功用三氯化铝和硫酸铜处理大鼠成功制作了AD 动物模型，其产生严重的空间记忆能力损害，并失去物体辨别能力，产生中枢神经炎症，胆碱能传递障碍等病理特征[27]。锑、锌等金属离子也可产生类似的效果[28]。这造模方法较为简单，通过饲喂即可诱导模型产生。但单一的金属离子诱导模型困难，最好联合转基因方法或其他非转基因方法例如Aβ寡聚体注射等。

9 总结与展望

现存的AD 转基因造模方法费用昂贵且造模时间长，但病理变化特征和人类AD 较为类似。而非转基因方法大多利用AD 的诱发因素进行操作，虽然操作简单造模成本低，但注射的方法都无法避免一定程度的脑损伤，且因注射位置固定导致病变范围较为局限，与AD 的全身性的病理特征有较大区别。每一种造模方法都有自己的优缺点，并没有一种模型能概括AD 的所有特征，选择合适的模型来评估潜在的治疗干预措施。最重要的是明确临床治疗的相关目标，确定治疗相关的时间点，所以实验者可以根据实验所需选择适合的模型进行造模。

非转基因方法未来的发展是解决脑外伤的问题，寻找一类可以通过血脑屏障的药物，或是对现存的药物进行修饰使之能过通过静脉注射，跨越血脑屏障发挥生物效应。现阶段对于Tau 过磷酸化形成神经纤维缠结，以及中枢神经炎症的研究处于高速发展阶段，这也将是动物模型的发展方向。目前AD动物模型造模方法已经取得了一定的进展，但由于AD 发病机制以及神经生物学基础、免疫基础以及生活中各类影响因素的研究尚未完善，对于AD 动物模型的研究依旧处于发展阶段，对于各种类型的AD 模型还需进一步研究和完善。