干旱条件下玉米转座子插入关联的表观调控分析

2024-04-09高晨曦郝陆洋胡悦李永祥张登峰李春辉宋燕春石云素王天宇黎裕刘旭洋

中国农业科学 2024年6期

高晨曦，郝陆洋，胡悦，李永祥，张登峰，李春辉，宋燕春，石云素，王天宇，黎裕，刘旭洋

中国农业科学院作物科学研究所/作物基因资源与育种全国重点实验室，北京 100081

0 引言

【研究意义】全球人口数量在2050 年预计将增长至97 亿，需要稳定增长粮食产量来养活不断增长的人口[1]。然而，随着全球气候的不断变化，作物生产越来越受到环境胁迫的限制，其中，干旱是最严重的胁迫因素之一[2-3]。玉米（ZeamaysL.）是世界范围最主要的粮食作物之一，也是我国种植面积最大、总产量最高的粮食作物，其生产高度依赖于充足的水肥。随着不断高产育种的改良，在过去的二十年间玉米的单产增加了大约50%[4]，然而，其对干旱的敏感程度也随之显著增加[5]。因此，提高抗旱性是玉米育种的重要目标。【前人研究进展】在玉米中，许多复杂性状的遗传变异是由顺式调控元件或表观遗传调控等调控变异控制[6]。Teosintebranched1（tb1）是一个典型的顺式调控变异控制玉米驯化表型的例子，tb1上游60 kb 的一个转座子插入能够增强其基因的表达并抑制分蘖的产生[7-8]。ZmCCT是水稻Ghd7的同源基因，ZmCCT顺式调控变异影响玉米在不同日照条件下的开花期[9-10]。一个Harbinger转座子插入能够抑制另一个CCT 基因ZmCCT9的表达，并且这个转座子插入在玉米对高纬度的适应及改良过程中受到显著的选择[11]。在玉米抗旱性方面，已克隆的ZmNAC111和ZmVPP1也均是通过基因表达变异调控玉米的抗旱性。MAO 等[12]通过全基因组关联分析挖掘出候选基因ZmNAC111，进一步分析发现在ZmNAC111启动子区域的一个微型倒置重复转座元件（miniature inverted-repeat transposable element，MITE）通过RNA介导的DNA 甲基化抑制了该基因的表达，从而调控玉米的苗期抗旱性。而在ZmVPP1启动子区域一个360 bp 的插入序列携带有3 个MYB 转录因子顺式调控元件，该元件赋予了ZmVPP1的干旱诱导表达能力并提高了玉米的抗旱性[13]。SUN 等[14]利用玉米关联群体在不同水分处理下开展了大规模干旱响应sRNA 鉴定，通过eGWAS 获得了29 个eQTL 热点，并克隆了位于第8 染色体的干旱特异性超级热点DRESH8，进一步分析发现DRESH8由一个Gypsy转座子组成，DRESH8的存在缺失变异调控了不同环境下玉米抗旱与产量的平衡。在真核生物中，转座子主要分为反转录转座子（retrotransposon）和DNA 转座子（DNA transposon）[15]。反转录转座子由3 个家族组成，即长末端重复（long terminal repeat，LTR）反转录转座子、长散在重复元件（long interspersed nuclear element，LINE）和短散在重复元件（short interspersed nuclear element，SINE），主要通过“复制-粘贴”机制进行复制。而DNA 转座子通过“剪切-粘贴”机制复制，包括2 个家族，即末端反向重复（terminal inverted repeat，TIR）转座子和Helitron。基因组Illumina 重测序是识别不同基因型间转座子插入缺失变异的一种经济有效的方法，尽管较小的测序读长在重复序列比对上具有一定的挑战。目前，利用Illumina 测序序列鉴定基因组转座子插入缺失变异主要有2 种策略。第一种策略是将测序序列比对至参考基因组，根据参考基因组的转座子注释信息鉴定转座子插入缺失，这类分析方法主要包括Jitterbug[16]、BreakDancer[17]和TEMP[18]等。第二种策略是首先将原始的测序数据比对至转座子序列筛选潜在的包含转座子的测序序列，然后将筛选后的序列比对至参考基因组鉴定转座子的插入位置，这类方法主要包括RelocaTE[19]、ITIS[20]和TRACKPOSON[21]等。DNA 甲基化是主要的表观遗传修饰方式之一[22]。在植物基因组中，转座子插入区域往往呈现CG 和CHG（H 代表A、T 或C 碱基）位点高度的DNA 甲基化水平[23]。其中Methyltransferase1（MET1）主要催化CG 中的5-甲基胞嘧啶，Chromomethylase3（CMT3）催化CHG位点的DNA 甲基化[24-25]。而CHH 的甲基化主要有2种途径，一是通过Domains Rearranged Methylase 2（DRM2）参与的RNA 介导的DNA 甲基化；二是CMT2 与Decreased DNA Methylation1（DDM1）共同控制的不依赖RNA 途径[26-27]。甲基化变异影响的基因表达变化是调控玉米表型变异的重要方式。TIAN等[28]利用抗旱玉米自交系CIMBL55 和B73、Mo17 等开展全基因组DNA 甲基化分析，在转录因子基因ZmNAC075对的启动子区域检测到差异的DNA 甲基化水平，在该基因B73 等位上游的2 个插入变异导致该等位基因比CIMBL55 的等位基因具有更高的CG、CHG 和CHH 甲基化水平，而在干旱胁迫下CIMBL55等位ZmNAC075的表达量显著高于携带B73 等位的种质。此外，DNA 甲基化变异在玉米重要性状形成和选择驯化中的作用也得到进一步阐明[28-31]。【本研究切入点】转座子介导的DNA 甲基化等表观修饰变异是调控表型变异的重要方式，并且在玉米的驯化和改良中得到有效利用，玉米抗旱性相关的全基因组转座子变异关联的DNA 甲基化和基因表达机制还有待进一步的深入解析。【拟解决的关键问题】本研究利用抗旱性极端差异的玉米自交系，开展全基因组的转座子插入缺失变异检测和田间不同水分处理下全基因组DNA 甲基化和转录组分析，解析转座子介导的DNA甲基化在玉米抗旱中的调控作用，为玉米抗旱种质改良和品种培育提供理论支撑和基因资源。

1 材料与方法

1.1 田间抗旱性鉴定

共选取实验室前期鉴定的抗旱性具有表型差异的8 个代表性自交系H082183、GM517、GH065、CN165、CML103、K12、昌7-2 和旅28 开展田间抗旱性鉴定，在中国农业科学院作物科学研究所昌平实验站利用自动雨棚开展田间试验。采取随机区组试验设计，设干旱和正常水分2 个处理和6 个重复，每个小区为两行区，行长3 m，行距0.6 m，每行种植11 个单株。干旱和正常水分处理均使用滴灌系统控制灌溉量，干旱处理在播种后灌溉一次，水量为450 m3·hm-2，此后停止浇水至试验结束；正常水分处理在播种后灌溉一次，此后每2 周灌溉一次，水量为600 m3·hm-2，有降雨时，2 种处理均使用旱棚设施进行遮雨。播种后5 周，当干旱处理下部分材料开始呈现明显的叶片卷曲时，取叶片测量叶片相对含水量，测量方法参考ZHANG 等[32]。同时取叶片和根系样品，每个重复5个单株混样，使用液氮迅速冷冻，并保存至-80 ℃备用。在开花期记录散粉期和吐丝期，在每行有超过一半植株散粉或吐丝当日记录为散粉期或吐丝期，并计算散粉-吐丝间隔。根据表型鉴定的结果，选取抗旱自交系H082183 和干旱敏感自交系旅28 进行下一步的组学分析。

1.2 基因组DNA 测序与转座子插入鉴定

取自交系H082183 和旅28 的幼苗样品，采用CTAB 法提取DNA。利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA样品的降解和污染情况，使用NanoPhotometer 分光光度计（IMPLEN）检测DNA 纯度，满足标准OD260/280＞1.8 和OD260/230＞2.0 的DNA 样品用于下一步测序文库的制备。利用NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina 试剂盒（NEB）制备DNA 测序文库，并使用Illumina NovaSeq 平台开展测序分析。利用fastp软件[33]进行测序数据质量控制获得clean reads。基因组测序数据已上传至NCBI 数据库（PRJNA1017638）。采用TRACKPOSON 软件进行全基因组转座子插入鉴定，首先将clean reads 比对至已知的玉米转座子序列获取候选的包含有转座子序列的reads，比对利用Bowtie2 软件[33]进行，玉米转座子序列下载自TREP数据库（http://botserv2.uzh.ch/kelldata/trep-db）、PGSBREdat 数据库（https://pgsb.helmholtz-muenchen.de/plant/recat）和Maize TE Annotations 数据库（https://mcstitzer.github.io/maizeTEs）。将含有转座子序列的reads 比对至玉米 B73_V4 参考基因组[34]（www.maizegdb.org），获取转座子的插入位置。

1.3 全基因组甲基化测序

针对玉米自交系H082183 和旅28，在田间试验的6 个重复中随机挑选2 个重复的叶片和根系样品，利用全基因组重亚硫酸盐甲基化测序（whole genome bisulfite sequencing，WGBS）技术开展基因组甲基化分析。采用CTAB 法提取基因组DNA，利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA 样品的降解和污染情况，使用NanoPhotometer 分光光度计（IMPLEN）检测DNA 纯度，满足标准OD260/280＞1.8 和OD260/230＞2.0 的DNA样品用于下一步测序文库的制备。使用Covaris S220（Covaris）将DNA 样品切割为平均长度为200—300 bp 的片段并进行3′端腺苷化处理，将胞嘧啶甲基化barcode 连接到DNA 片段上，并使用EZ DNA 甲基化金试剂盒（ZYMO RESEARCH, USA）进行亚硫酸氢盐转化处理，将未甲基化的胞嘧啶（C）转化为尿嘧啶（U）。随后使用KAPA HiFi HotStart Uracil+ Kit试剂盒（Roche, SUI）构建测序文库，并使用Illumina Hiseq X TEN 平台进行测序分析。甲基化测序数据已上传至NCBI 数据库（PRJNA688754）。采用Bismark软件[35]开展测序序列的比对分析，参考基因组为V4版B73 参考基因组。利用DSS 软件[36]和R 语言的methylKit 包[37]开展差异甲基化区域分析，显著差异的标准为甲基化差异＞20%并且FDR＜0.05。

1.4 转录组测序

利用以上甲基化测序使用的相同叶片和根系组织开展转录组测序分析。采用TRIzol 法提取样品的总RNA，使用琼脂糖凝胶电泳和NanoPhotometer 分光光度计（IMPLEN）检测RNA 样品的完整度和纯度，利用满足标准OD260/280＞2.0、OD260/230＞2.0 和RIN＞6.5的RNA 样品用于下一步的建库测序。采用NEBNext UltraTMRNA Library Prep Kit for Illumina（NEB）试剂盒进行测序文库的构建，并使用Illumina Hiseq X 平台开展测序分析。转录组测序数据已上传至NCBI 数据库（PRJNA1017679）。质控过滤得到的clean reads通过Hisat2 软件[38]比对至玉米B73_V4 参考基因组。利用featureCounts 软件[39]计算基因的reads count 和FPMK 值，采用DESeq2 软件[40]鉴定差异表达基因，差异表达基因的鉴定标准为log2(fold change)＞1 或＜-1 以及FDR＜0.05。基因共表达网络分析根据WGCNA 软件[41]开展，其中soft-threshold power 设为9，cut-off threshold 设为0.9，minimal module size设为30。利用GOseq 软件[42]开展GO 注释和富集分析。

1.5 RT-qPCR 分析

在李燕等[43]田间试验中，在V12 期对不同水分处理下的H082183 和旅28 叶片和根系组织进行取样，共3 个生物学重复，每个重复5 个单株混样。总RNA提取采用RNA Easy Fast 植物组织RNA 快速提取试剂盒（天根），cDNA 文库构建采用One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix（全式金），使用 SYBR qPCR Master Mix（诺唯赞）和 ABI Quantstudio3 实时荧光定量PCR 仪（ThermoFisher）开展ZCN7的RT-qPCR 分析。ZCN7的RT-qPCR 引物为5′-CCACTGCATGGCTACACTATATAAT-3′和5′-CTTGGAGAATACTTTGTCTGATTAATCA-3′，内参基因GAPDH的引物为5′-CCCTTCATCACCACGG ACTAC-3′和5′-AACCTTCTTGGCACCACCCT-3′，采用2-∆∆Ct法计算基因的表达量，每个样品3 次重复。

2 结果

2.1 田间抗旱性表型分析

在田间干旱和正常水分处理下开展8 个代表性自交系的叶片相对含水量测定，结果表明，在正常水分处理下，所有材料的叶片相对含水量均在93%以上。而在干旱处理下，除H082183 外，其他自交系的叶片相对含水量均较正常处理显著（P＜0.05）下降，其中，旅28 的叶片相对含水量仅为76.7%（图1-A）。干旱会导致玉米雌雄花发育不协调，造成花期不遇授粉困难从而影响籽粒产量。对8 个自交系的散粉-吐丝间隔鉴定结果表明，H082183、GM571、K12 在干旱和正常水分处理下的散粉-吐丝间隔差异不显著，而其他自交系在干旱下的散粉-吐丝间隔显著大于正常水分环境。其中，H082183 在干旱下的散粉-吐丝间隔最小，平均仅为0.69 d，而旅28 的散粉-吐丝间隔最大，平均为6.20 d（图1-B）。以上结果表明，H082183 的抗旱性较强，而旅28 在所有试验材料中表现出最差的抗旱性。

图1 田间抗旱表型分析及抗旱性差异自交系的基因组转座子插入和DNA 甲基化水平分析Fig. 1 Drought tolerance-related phenotype and genomic distribution of variable transposable element insertions and DNA methylation levels

2.2 H082183 和旅28 的基因组转座子插入缺失变异分析

选取抗旱自交系H082183 和干旱敏感自交系旅28，利用Illumina 测序平台开展30X 深度的全基因组重测序，利用TRACKPOSON 算法分析2 个基因组中的转座子插入缺失变异。在H082183 和旅28的基因组中分别鉴定到333 754 和333 296 个转座子插入（表1）。其中数量最多的是Gypsy和Copia类的LTR 反转录转座子，从基因组的分布情况来看，Copia转座子在整个基因组区域均有分布，而Gypsy转座子大多分布在富含重复序列的着丝粒区域（附图1）。此外，通过H082183 和旅28 基因组的比较分析，共检测到89 954 个转座子插入缺失变异（图1-C）。

表1 H082183 和旅28 基因组中转座子插入数量Table 1 Transposable element insertions of each superfamily in H082183 and Lü28 genomes

2.3 H082183 和旅28 的全基因组DNA 甲基化分析

通过对2 个玉米自交系的全基因组甲基化测序共获得50.4 亿测序片段，平均每个测序样本3.15 亿测序片段。全基因组甲基化测序分别覆盖了H082183和旅28 基因组49.0%和46.9%的胞嘧啶碱基位点。从甲基化位点分布情况来看，玉米基因组中的DNA甲基化主要为CG 和CHG 位点，而CHH 甲基化所占的比例较小（图2-A）。CG 和CHG 位点在转座子、内含子和基因启动子区域有较高的甲基化水平，而在外显子和非编码区域的甲基化水平较低；CHH 位点在启动子区域具有较高的甲基化水平，而在转座子、基因编码区和非编码区的甲基化水平较低（图2-B—D）。对转座子的进一步分析发现，CG 和CHG甲基化水平在转座子插入位点保持较高的水平，而随着距离转座子插入位点的增大而减小，在超过50 kb距离时快速衰减（图3-A—B）。

图2 不同基因组区域的DNA 甲基化水平Fig. 2 DNA methylation levels in different genomic regions

图3 转座子DNA 甲基化水平和差异甲基化分析Fig. 3 DNA methylation levels around transposable element and differentially methylated regions

通过干旱下2 个玉米自交系叶片和根系组织基因组甲基化水平的比较分析，共检测到41 352个CG 和CHG 差异甲基化区域（图3-B）。其中16.9%的CG 差异甲基化区域位于基因内部，22.5%的CG 差异甲基化区域位于基因启动子；11.7%的CHG 差异甲基化区域位于基因内部，17.3%的CHG差异甲基化区域位于基因启动子。此外，60.6%和70.9%的CG 和CHG 差异甲基化区域均位于基因间区（图3-C）。对转座子插入缺失变异和差异甲基化进行对比分析，发现60%的差异甲基化区域位于转座子插入缺失变异的上下游 5 kb 范围内（图3-D）；如果将转座子插入缺失变异的上下游范围扩大至50 kb，95%的差异甲基化区域将位于此区间内（附图2）。

2.4 H082183 和旅28 的转录组分析

利用甲基化测序的相同样品开展转录组测序，并与全基因组甲基化结果进行比较分析。结果表明，基因表达水平与CG 和CHG 甲基化水平负相关，表达量较高的基因在基因区域及基因上下游区间均具有较低的CG 和CHG 甲基化水平，并且2 个自交系间的基因表达差异倍数与基因甲基化差异倍数显著负相关（图4-A—B）。通过差异表达分析共检测到干旱条件下H082183 和旅28 在叶片和根系中的差异表达基因4 196和3 500个，其中821（19.5%）和690（19.7%）个差异表达基因与差异甲基化区域关联（图4-C）。对差异甲基化关联的差异表达基因进行GO 注释和富集分析，发现这些基因在质膜相关的GO 条目中显著富集（图4-D）。此外，一些DNA 甲基转移酶和DNA 去甲基酶等相关基因在2 个自交系间的表达量具有差异，如，旅28 中ZmCMT2a和ZmDRM2a的表达量在不同水分处理和不同组织中均显著高于H082183，而ZmRDDM3a在H082183 叶片中的表达量显著高于旅28（图5）。

图4 差异甲基化和差异表达基因比较分析Fig. 4 Comparison analysis of differentially methylated regions and differentially expressed genes

图5 DNA 甲基化酶和去甲基化酶的基因表达分析Fig. 5 Expression levels of DNA methyltransferase and demethylase genes

2.5 转座子插入介导的ZCN7 基因表观调控分析

实验室前期利用H082183 和旅28 克隆了一个控制玉米花期抗旱性的关键基因ZCN7[43]，对2 个自交系中ZCN7附近的转座子插入、DNA 甲基化和其基因表达进行分析。在ZCN7上下游基因组区域检测到3个转座子插入缺失变异，均在旅28 中存在而H082183基因组中缺失。3 个转座子为LTR 类转座子，其中一个转座子位于ZCN7上游约33.2 kb 处，2 个转座子位于ZCN7下游约5.2 和10.1 kb 处（ZCN7在参考基因组中的方向为从右至左，即上游序列在右侧，下游序列在左侧）。自交系旅28 中ZCN7周围的转座子插入导致其DNA 甲基化水平显著高于H082183，其中，ZCN7上游35 kb 至下游11 kb 的区域在干旱和正常水分处理的叶片中均被鉴定为CG和CHG差异甲基化区域（图6-A）。

图6 转座子插入介导的ZCN7 表观调控分析Fig. 6 Transposable element insertion associated epigenetic regulation of ZCN7

转录组测序结果表明，在干旱和正常水分处理下ZCN7在H082183 叶片中的表达量均显著高于旅28，根据以上结果推测其在旅28 较高DNA 甲基化水平抑制了ZCN7基因的表达（图6-B）。为了验证这一结果，利用前期田间抗旱试验[43]中H082183 和旅28 的叶片和根系样品开展ZCN7表达量的RT-qPCR分析，同样，结果表明，不同水分处理下ZCN7在H082183 的表达量显著高于旅28（图6-C）。此外，转录组和RT-qPCR 结果均表明，ZCN7主要在叶片中表达，而在根系中的表达量较低。

为了进一步解析ZCN7 的抗旱调控机制，利用H082183 和旅28 在不同水分处理下的转录组数据和WGCNA 算法构建基因共表达调控网络，结果表明，与ZCN7共表达的基因包括有脱落酸合成关键限速酶基因CarotenoidCleavageDioxygenase4b（CCD4b）、液泡膜水通道蛋白基因TonoplastIntrinsicProtein4（TIP4）、环核苷酸门控通道蛋白基因CyclicNucleotide-Gated ChannelProtein15（CNGC15）、扩展蛋白基因α-Expansin11（EXPA11）、神经酰胺激酶基因AcceleratedCellDeath6（ACD6）、蛋白激酶基因ConstitutiveTripleResponse2（CTR2）、锌指蛋白基因AZF2、转录因子基因bZIP15等。

3 讨论

3.1 转座子插入缺失变异是调控玉米性状变异的重要方式

自MCCLINTOCK[44]在1950 年首次在玉米中发现转座子以来，越来越多的研究表明，转座子在不同物种的基因组中广泛存在并在表型变异调控中发挥重要作用。玉米基因组中大多数序列是由转座子组成的，并且呈现出高度多样性的转座子插入缺失变异，如ANDERSON 等[45]在4 个玉米基因组间共鉴定出超过40 万个转座子插入缺失变异，这些转座子变异占玉米基因组的72%。本研究利用抗旱性具有显著差异的玉米自交系H082183 和旅28，利用全基因组重测序方法在H082183 和旅28 的基因组中分别鉴定到333 754和333 296 个转座子插入，2 个自交系间多样性的转座子占基因组的19.6%（图1 和表1）。这一结果与ANDERSON 等[45]在玉米B73、W22、Mo17 和PH207基因组中检测到的转座子插入数量（分别为338 224、314 413、301 722 和238 826）较为一致，表明本研究所使用的转座子插入检测方法较为可靠。鉴于转座子插入缺失变异在玉米基因组中的庞大数量和规模，其往往与重要的表型变异相关联。例如ZmNAC111启动子区域的一个MITE 转座子插入能够调控其基因表达并控制玉米苗期抗旱性[12]。Vegetativetogenerative transition1（Vgt1）中的一个MITE 转座子插入缺失与玉米的开花期显著关联[46]。ZmCCT9上游57 kb 处的一个Harbinger转座子插入在长日照条件下能够促进开花[11]。此外，转座子插入也是一种获得突变的有效方式，在反向遗传学和功能基因组研究中发挥了重要的作用，如Mutator（Mu）插入和Activator/Dissociation（Ac/Ds）插入是玉米常见的突变体库构建方法[47-49]。

3.2 转座子可以通过多种途径调控基因功能

转座子影响基因功能主要有以下几种方式，其主要由转座子的插入位置决定的。第一种是转座子插入到基因内部能够改变基因的转录本，从而产生基因的功能缺失突变。如玉米U6biogenesis-like1（UBL1）内含子区的一个Mutator转座子插入影响其mRNA 的剪切，产生了ubl1功能缺失突变体并表现籽粒减小的表型性状[50]。然而，转座子插入产生的新转录本也有一定的概率会产生新的生物学功能。ZmACS7编码一个乙烯合成途径中的1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）合酶，其外显子区域的Mutator转座子插入产生新转录本编码的蛋白具有增强的蛋白稳定性而不影响其催化活性，从而增强了乙烯的合成并显著降低玉米株高[51]。此外，近期研究表明转座子插入也可以通过影响蛋白的翻译效率调控蛋白的表达量，BTA（B73 active TE hAT）插入到糖转运蛋白基因ZmSWEET4c的外显子，通过产生uORF 及其自身的二级结构抑制了ZmSWEET4c的翻译效率和蛋白丰度，从而导致玉米籽粒大小改变[52]。第二种是转座子插入在基因上下游区域可以干扰基因的顺式调控元件从而影响基因的表达。例如以上提到的开花期关键调控基因ZmCCT9，其上游57 kb的Harbinger转座子插入就是通过长距离的顺式调控抑制基因的表达[11]。此外转座子插入也可能产生新的启动子或增强子而增强基因的表达。玉米株型调控关键基因tb1上游的LTR 转座子插入产生了新的增强子并显著提高tb1的基因表达量[8]。第三种是转座子插入往往与高度的DNA 甲基化关联，从而通过表观遗传调控抑制了周围基因的表达。一个经典的案例是Vgt1中的MITE 转座子插入改变了其DNA甲基化水平，而Vgt1是花期抑制基因ZmRap2.7上游70 kb 的非编码调控元件[46]。NOSHAY 等[23]利用4 个玉米基因组比较分析了转座子插入缺失多样性与DNA 甲基化水平差异，发现LTR 和TIR 家族的转座子大多具有高度的CG 和CHG 甲基化水平，并且发现大多数插入至非甲基化区域的转座子改变了其插入位置的甲基化水平。本研究结果表明，高达60%的差异甲基化区域位于转座子插入缺失变异的上下游5 kb范围内（图3），此外约有20%的差异表达基因与差异甲基化区域重叠（图4），这一结果说明转座子插入缺失介导的DNA 甲基化变异在玉米表观修饰调控中占重要地位。

3.3 转座子插入缺失介导的ZCN7 表观调控模式拓展了玉米抗旱性的分子机制

FlowerLocusT（FT）和TerminalFlower1（TFL1）是拟南芥中调控开花的核心节点基因，FT和TFL1为同源基因，均编码磷脂酰乙醇胺结合蛋白（PEBP），但在调控拟南芥开花过程中具有拮抗作用[53-54]。在玉米基因组中有25 个FT/TFL1 的同源基因被命名为ZEA CENTRORADIALIS（ZCN），包括15 个FT 类基因、6 个TFL1 类基因和3 个MOTHER OF FT AND TFL1（MTL1）类基因[55]。其中报道较多的是ZCN8，该基因与indeterminate1（id1）和ZmMADS69的互作调控能够控制玉米花期，并在玉米对高纬度的驯化过程中受到选择[56-57]。玉米ZCN 基因家族中ZCN7与ZCN8具有最相似的蛋白序列和基因表达调控模式[58]。本试验前期对ZCN7的研究发现，该基因主要在玉米叶片中表达，在V12 期的叶片中表现出表达峰值；通过ZCN7过表达转基因玉米的抗旱表型鉴定发现，过表达ZCN7能够显著缩短干旱下的散粉-吐丝间隔并提高玉米籽粒产量[43]。本研究利用抗旱性差异自交系H082183 和旅28，对ZCN7和上下游区域的转座子插入、DNA 甲基化变异以及基因表达网络等进行了综合分析，发现旅28 中ZCN7附近的3 个LTR 转座子插入导致其DNA 甲基化程度显著高于H082183，较高的DNA 甲基化水平抑制了旅28 中ZCN7的表达，在此基础上提出了转座子插入缺失变异介导的ZCN7表观调控模式（图6-E）。同时通过基因共表达分析获得了一批不同水分处理下与ZCN7共表达的候选基因。这些结果为进一步阐明ZCN7调控玉米抗旱性的分子机制提供了理论支撑。