对银屑病患者外周血中性粒细胞胞外诱捕网形成的观察

屈小燕 陈盼 倪文琼 肖辉 （郑州大学附属郑州中心医院皮肤科，郑州 450007）

银屑病是一种常见的慢性炎症性皮肤疾病，成人和儿童均可发病，全身泛发的皮损给个人带来巨大的经济负担和心理负担［1］。除了皮肤损害，银屑病患者发生某些其他系统疾病共病的概率升高，包括银屑病关节炎、心血管疾病、代谢综合征和自身免疫性疾病等［2］。银屑病与其共病的机制尚不清楚，现有研究认为其由遗传因素和环境因素共同引起［3］。许多经典的（包括T细胞、树突状细胞和中性粒细胞）和非经典的免疫细胞（如角质形成细胞）参与了银屑病的发病，其中短寿命的中性粒细胞（poly morphonuclear neutrophil，PMN）可能发挥一定作用［4-6］。

中性粒细胞可以率先捕获外源性的刺激，如细菌、病毒等，并通过独特的死亡机制释放中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps，NETs）［7］。2004年，BRINKMANN等［8］描述了这一机制，即组蛋白3（Histone 3，H3）瓜氨酸化修饰使染色质解螺旋，最终导致颗粒来源蛋白修饰的染色质纤维网（即NETs）的程序性外化，该过程被命名为NETosis。已有研究发现，NETs作为一种天然的生物防御机制，其升高与炎症反应和相关疾病如肥胖、自身免疫性疾病、动脉粥样硬化和癌症等有关［9-10］。

本研究通过观察银屑病患者外周血和皮损中PMN形成NETs的情况，并与临床分型、疾病严重性及炎症指标进行相关性分析，探索NETs与银屑病发病的相关性，以期为研究中性粒细胞参与银屑病发病的机制提供参考。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 一般资料 将2018年8月至2020年12月就诊于郑州大学附属郑州中心医院皮肤科的符合中国银屑病诊疗指南诊断标准的63例银屑病患者作为银屑病组，其中斑块型39例、点滴型11例、红皮病型5例、脓疱型6例、关节型2例。上述患者均由皮肤科2位主任医师参照《中国银屑病治疗专家共识（2014版）》《中国银屑病诊疗指南（2018完整版）》明确诊断。同时选取性别、年龄匹配的同期健康体检者27例作为对照组（排除血常规异常、肝功能指标异常、急慢性感染、过敏性疾病、自身免疫病患者），分别抽取2 ml外周血，同时对银屑病患者的皮损严重程度进行评估（PASI、BSA评分），收集银屑病组及对照组的家族史，以及血常规、血清IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ、ASO、RF、CRP、PCT、ESR、血糖、血脂、血尿酸等临床资料，并计算中性粒细胞/淋巴细胞（neutrophil/lymphocyte ratio，NLR）、外周血血小板/淋巴细胞（platelet/lymphocyte ratio，PLR）、系统免疫炎症指数（systemic immune-inflammation index，SII）、衍生中性粒细胞/淋巴细胞（derived neutrophil/lymphocyte ratio，dNLR）等常见的血液炎症指标。同时采集其中5例银屑病患者皮损。该研究通过郑州大学伦理委员会审查，所有参与者均已签署知情同意书。

1.1.2 主要试剂 Histopaque-1119、Histopaque-1077（Sigma）；红细胞裂解液、BSA（索莱宝）；抗瓜氨酸化组蛋白3（Histone 3 citrullinated，H3Cit）、抗MPO、荧光标记的山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG（Abcam）；抗荧光淬灭封片液（碧云天）。

1.2 方法

1.2.1 分离外周血中性粒细胞 采用密度梯度离心法分离外周血中性粒细胞。离心管中依次缓慢加入Histopaque-1119 4 ml、Histopaque-1077 2 ml、外周血（采血后1 h内进行）2 ml，700 g室温离心30 min。小心吸取中性粒细胞层细胞悬液，PBS洗涤1次，再经红细胞裂解液分离得到中性粒细胞。

1.2.2 外周血和皮损NETs免疫荧光染色 将分离的中性粒细胞接种于6孔板，贴片1 h后，4%多聚甲醛固定液固定20 min，0.2%Triton X-100透膜10 min，5%BSA封闭1 h后，再用5%BSA稀释的H3Cit和抗MPO混合一抗4 ℃孵育过夜，PBS洗涤3次后，用5%BSA稀释的荧光标记的山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG混合二抗室温避光孵育1 h，PBS洗涤3次。抗荧光淬灭封片液封片后，置于荧光显微镜下观察NETs的形态及数量。每例样本在200倍镜下随机选取10个视野采集图像。采用Image J图像分析软件分析荧光强度及半定量计数，以每个视野内H3Cit（+）细胞数/DNA（+）细胞数作为NETs阳性率，以H3Cit的绿色荧光强度和面积代表NETs的荧光强度和面积。对制备好的银屑病患者的蜡块切片，进行抗原修复后处理，具体步骤同外周血中性粒细胞的免疫染色。

1.3 统计学处理 对银屑病组及对照组外周血自发NETs情况进行统计学分析，同时将银屑病组的NETs与临床炎症指标及疾病严重性进行相关性分析，采用IBM SPSS Statistics 23.0软件进行统计分析。所有统计测试都是双向的。多组对比采用Kruskal-Wallis Test，两组间对比采用Mann-WhitneyUtest。相关性分析采用Pearson检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 银屑病组皮损中NETs形成情况 荧光显微镜下观察NETs的表达情况。银屑病患者皮损的Munro微脓肿中可见H3Cit阳性表达（图1）。

图1 1例银屑病患者皮损中NETs表达情况Fig.1 Expression of NETs in psoriatic lesions in 1 patient

2.2 银屑病组及对照组外周血自发NETs情况对比 荧光显微镜下观察NETs的形态及数量。结果显示：银屑病患者外周血中NETs的阳性率、H3Cit的总荧光强度、平均荧光强度、荧光面积均显著高于健康对照组，差异有统计学意义（P＜0.01，图2、表1）。

表1 银屑病及健康对照者外周血自发NETs阳性率及荧光强度对比分析表Tab.1 Comparative analysis table of positive rate and fluorescence intensity of spontaneous NETs in peripheral blood of psoriasis patients and healthy controls

图2 银屑病组及健康对照组自发NETs情况Fig.2 Spontaneous NETs in psoriasis group and healthy control group

2.3 NETs阳性率与银屑病严重程度相关性分析为了解NETs作为银屑病临床指征的可能性，评估NETs产生与银屑病严重程度的相关性。结果如下：外周血NETs阳性率与银屑病PASI评分呈正相关（r=0.31，P=0.013），与BSA评分无明显相关性（r=0.17，P=0.175，图3）。

图3 银屑病外周血NETs阳性率与PASI、BSA相关性散点图Fig.3 Scatter plot of correlation between positive rate of NETs in psoriatic peripheral blood and scores of PASI and BSA

2.4 各型银屑病间自发NETs比较分析 为了解NETs形成与银屑病分型间的关系，本研究对比了各型银屑病间的NETs形成情况，结果显示，斑块型、点滴型、红皮病型、脓疱型、关节型银屑病组间的NETs阳性率、总荧光强度、平均荧光强度、荧光面积均差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.5 外周血NETs与银屑病临床指标相关性分析回顾性收集患者代谢相关、TNF-α、IL-6、CRP、PCT等实验室检测资料，将银屑病组分为结果正常组及结果异常组，分析两组间PASI、BSA、自发NETs的差异情况，结果如下：以代谢异常作为影响因素的研究部分，共收集48例银屑病患者资料，其中合并代谢异常的患者23例（占总人数的47.92%），不合并代谢异常的患者25例（占总人数的52.08%），对比两组发现，合并代谢异常组的NETs荧光面积显著高于未合并代谢异常组（P=0.03）；高TNF-α组有患者20例（占总人数的47.62%），正常TNF-α组有患者22例（占总人数的52.38%），高TNF-α组的NETs总荧光强度和荧光面积均显著高于正常TNFα组（P=0.01）；高IL-6、CRP、PCT组NETs阳性率、平均荧光强度、总荧光强度和荧光面积及PASI、BSA评分较正常IL-6、CRP、PCT组差异均无统计学意义（P＞0.05，表2）。

表2 银屑病组临床指标与NETs及疾病严重性相关性分析Tab.2 Correlation analysis of laboratory indicators with NETs and disease severity in psoriasis group

2.6 外周血炎症标志物与银屑病严重程度及外周血自发NETs的相关性分析 本研究收集银屑病组及健康对照组的NLR、PLR、SII、dNLR等数据，并与NETs及疾病严重性进行相关性分析，以探索其作为评价银屑病疾病严重性的可能性。结果如下：银屑病组NLR、PLR、SII、dNLR较健康对照组差异均无统计学意义（P＞0.05，表3）。银屑病组的NLR、PLR、SII、dNLR与PASI、BSA、NETs的阳性率、总荧光强度、平均荧光强度及荧光面积间均无相关性（Pearson检验，P＞0.05）。此外，本研究分别根据银屑病组NLR、PLR、SII、dNLR的中位数将银屑病患者分为高NLR、PLR、SII、dNLR组（≥中位数）和低NLR、PLR、SII、dNLR组（＜中位数），对比两组的PASI、BSA及自发NETs情况，结果显示两组PASI、BSA、NETs的阳性率、总荧光强度、平均荧光强度及荧光面积差异均无统计学意义（P＞0.05，表2）。

表3 银屑病组及健康对照组血清炎症指标分析Tab.3 Analysis of serum inflammatory indexes in psoriasis group and healthy control group

3 讨论

遗传和环境因素与银屑病的发病密切相关［11］。在遗传易感性和环境触发器之间的相互作用中，微生物群入侵导致的感染可能是一个关键角色［12］。而中性粒细胞作为感染早期响应的免疫细胞，在接收来自微生物的刺激后发挥的作用与银屑病的炎症免疫反应有相关性。

中性粒细胞在银屑病中作为固有免疫反应中的“先锋士兵”，可通过吞噬、脱颗粒作用或活化转变为NETs参与免疫应答［13-14］。研究表明，在类银屑病小鼠模型中，消耗中性粒细胞可缓解类似银屑病的皮损症状［15］。在药物诱导的粒细胞缺乏症患者中银屑病皮损情况得到改善，而在中性粒细胞计数正常化后银屑病复发［16］。而且，有研究发现，银屑病患者外周血和皮损中NETs含量明显升高［17］。在咪喹莫特诱导的银屑病小鼠模型中，连续7 d静脉注射CI-酰胺后，小鼠外周血中NETs含量明显下降，皮肤细胞表达的炎症因子水平降低，小鼠背部皮肤的鳞屑和棘层肥厚也减少，提示抑制NETs释放可显著缓解银屑病［18］。本研究发现银屑病患者外周血NETs形成增多，且与银屑病PASI评分呈正相关，提示在银屑病中，中性粒细胞可能以形成NETs的方式参与银屑病发病，但其具体机制尚不明确。现有研究发现NETs中包含大量趋化因子和炎症因子等成分，可促使未活化的中性粒细胞从血管中大量趋化、迁移至表皮并进一步分泌NETs，形成以中性粒细胞反复激活为基础的免疫激活循环［19］。在这一循环中，持续激活的中性粒细胞释放NETs的同时，激活pDC，与Th1、Th17相互作用，释放大量趋化因子和炎症因子，刺激角质形成细胞［20］。因此，检测外周血NETosis细胞可能作为评估银屑病患者病情的一个炎症指标，或为靶向中性粒细胞的治疗提供依据。

本研究还发现银屑病患者血清TNF-α与NETs存在相关性。这种相关性在类风湿关节炎和放射性轴性脊柱关节炎中也有报道，且后者在应用Infliximab治疗后发现NETosis生成减少［21-22］。还有研究发现，在类风湿关节炎患者中，运用Infliximab治疗可通过抑制NETs的形成减少炎症因子产生，改善疾病活动性［23］。以上研究结果说明TNF-α可能促进NETs的形成，而NETs有可能成为TNF-α单抗治疗银屑病的疗效评估指标之一

近年来多项研究发现NETs的产生与多种非感染性急慢性疾病的发生和进展密切相关［24］。环境因素如微生物感染、压力、吸烟、肥胖和饮酒，作为银屑病的关键危险因素和触发因素，对机体的影响是全身性的，因此银屑病也常常与其他疾病共病，越来越多的临床研究证实银屑病常合并代谢相关疾病［25］。有研究认为，代谢综合征直接增加了银屑病患者心血管疾病和过早死亡的风险，从而大大降低了他们的预期寿命［26］。这些共病中长期的代谢紊乱可引起固有免疫的长程激活，造成持久的代谢性炎症，炎症细胞产生的氧化应激环境和炎症因子将为NETosis过程提供有利的微环境，在某个触发因素的影响下引起银屑病复发［27］。研究表明，2型糖尿病及其相关的动脉粥样硬化中，NETs形成明显增加，与ApoE-/-敲除小鼠相比，通过敲除中性粒细胞弹性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）和蛋白酶-3进而抑制NETosis的ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化病变明显减轻［28］。而对患有代谢综合征和1型糖尿病的受试者使用Secukinumab进行治疗，反应较好的患者平均体重、腰围和BMI与对照组相比持续下降［29］。这些发现都说明NETs与银屑病及其代谢相关共病密切关联。本研究显示合并代谢异常的银屑病患者相对不合并代谢异常的银屑病患者，其外周血自发NETs增强，NETs有可能是关联银屑病及其共病之间的机制之一。针对中性粒细胞，特别是针对NETs的药物可能成为银屑病的治疗靶点之一。银屑病的治疗药物富马酸二甲酯具有削弱中性粒细胞功能和抑制NETs形成的作用，从另一方面佐证了NETs作为银屑病治疗靶点的可能性［30］。

急性感染是银屑病触发和复发机制中的关键因素，而中性粒细胞是早期响应急性感染的“种子”，代谢紊乱患者体内的炎症状态为这一过程提供“肥沃土壤”，促使中性粒细胞NETosis释放NETs，在此微环境中，炎症免疫反应迅速级联扩大，最终导致银屑病的发生发展及复发。而这一过程涉及的具体机制还需要更深入的探索和研究。