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乌梅丸通过调控miR-146a对溃疡性结肠炎大鼠结肠细胞凋亡的影响及机制研究

2024-04-09杨雪储琳泰州市中医院药学部泰州5300泰州市中医院脾胃病科泰州5300

中国免疫学杂志 2024年3期
关键词:乌梅存活率结肠

杨雪 储琳 (.泰州市中医院药学部,泰州 5300;.泰州市中医院脾胃病科,泰州 5300)

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)是一种结肠和直肠慢性炎症性疾病,多由遗传、肠道环境、感染等因素共同作用引起,与大肠黏膜及黏膜下层有关,病程漫长,常反复发作、难以治愈[1-2]。UC发病原因尚不明确,其治疗主要以西药控制炎症为主,虽有一定疗效,但易引起较多不良反应[3]。近年中医治疗UC已成为医学研究热点,效果明显[4]。乌梅丸是汉代张仲景《伤寒杂病论》中治疗厥阴病的方剂,临床可用于治疗上热下寒所致头痛、心烦、口干咽燥、腹痛、下痢、呕吐、手足厥冷等,具有缓肝调中、清上温下的作用,临床研究已证明乌梅丸对UC有明显治疗效果[5-6]。微小RNA(miRNA)可参与调节多种基因表达,近年研究显示miRNA与UC发病有关,如炎症性肠病(UC、克罗恩病)患者外周血单个核细胞中miR-146a表达上调,与病情严重程度有关[7]。乌梅丸与miR-146a对UC大鼠模型的影响未见报道,鉴于此,本实验主要探讨乌梅丸通过调控miR-146a对UC大鼠结肠细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 50只SD雄性大鼠,体质量(220.33±20.16) g,购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司,许可证号:SCXK(湘)2020-0002,本研究经泰州市中医院实验动物伦理委员会批准(20220012)。

1.1.2 药物 乌梅丸组成:乌梅16 g、附子6 g、干姜10 g、细辛6 g、桂枝6 g、蜀椒4 g、黄连16 g、黄柏6 g、人参6 g、当归4 g。药物经水浸泡后,常规煎煮、过滤及浓缩。所有药物均购自北京同仁堂有限责任公司。

1.1.3 试剂 DMEM培养基购自美国Sigma公司;胰蛋白酶购自美国Invitrogen公司;CCK-8试剂购自上海碧云天生物技术研究所;胎牛血清购自美国Gibco公司;Trizol试剂购自大连宝生物科技有限公司;凋亡试剂盒购自北京索莱宝生物科技有限公司;ELISA试剂盒购自上海酶联生物技术有限公司;BCA试剂盒购自北京天根生化科技公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与分组 选取50只SD大鼠,每组10只,分为正常对照组(给予10 ml/kg生理盐水)、模型组(TNBS/乙醇灌肠诱导UC形成)、乌梅丸低、中、高剂量组(灌胃13.3、26.6、53.2 g/kg乌梅丸)。UC大鼠结肠细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基于37 ℃、5%CO2培养,细胞融合至80%~90%时,0.25%胰蛋白酶消化传代,取对数生长期细胞进行实验。将anti-miR-NC、anti-miR-146a模拟物分别转染至UC大鼠结肠细胞,作为anti-miR-NC组、antimiR-146a组;将miR-NC、miR-146a分别转染至UC大鼠结肠细胞,乌梅丸干预,作为乌梅丸+miR-NC组、乌梅丸+miR-146a组。

1.2.2 CCK-8检测细胞增殖 每组取1×104个细胞接种于96孔板,贴壁后每孔添加10 μl CCK-8孵育2 h,酶标仪检测450 nm处光密度(OD)值。

1.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡 调整各组细胞浓度为2×105个/ml,取5 μl Annexin V-FITC加入500 μl细胞悬液混合,加入5 μl PI,室温暗室孵育1 h。流式细胞术分析染色情况,计算细胞凋亡率。

1.2.4 RT-qPCR检测miR-146a表达 Trizol试剂提取各组细胞总RNA,分光光度计测定RNA浓度,逆转录试剂盒合成cDNA。SYBR Green PCR Master Mix试剂盒进行扩增,2-ΔΔCt计算miR-146a相对表达。

1.2.5 试剂盒检测细胞IL-1β和IL-13含量 提取细胞上清,ELISA试剂盒检测IL-1β和IL-13含量,严格按说明书操作。

1.2.6 Western blot检测细胞蛋白表达 提取总蛋白,BCA测定蛋白浓度,SDS-PAGE电泳,转至PVDF膜,5%脱脂奶粉室温封闭1 h,加入一抗4 ℃孵育过夜,加入二抗室温孵育90 min,ECL发光液显影,ChemiDoc XRS+系统成像,Quantity One软件测定各组蛋白条带灰度值。

1.3 统计学分析 采用SPSS22.0软件进行统计学分析,计量资料用±s表示,两组比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 乌梅丸对UC大鼠结肠细胞增殖的影响CCK-8结果显示,模型组细胞存活率显著低于正常对照组(P<0.05);乌梅丸低、中、高剂量组细胞存活率显著高于模型组(P<0.05)。见表1。

表1 乌梅丸对UC大鼠结肠细胞增殖的影响(±s,n=10)Tab.1 Effects of Wumei Pill on proliferation of colon cells in UC rats (±s,n=10)

表1 乌梅丸对UC大鼠结肠细胞增殖的影响(±s,n=10)Tab.1 Effects of Wumei Pill on proliferation of colon cells in UC rats (±s,n=10)

Note:Compared with control group, 1)P<0.05; compared with model group, 2)P<0.01.

Survival rate/%96.73±8.11 40.34±6.711)65.45±3.752)72.76±6.362)88.93±9.642)375.775 0.000 Groups Control Model Wumei Pill low dose Wumei Pill medium dose Wumei Pill high dose F P

2.2 乌梅丸对UC大鼠结肠细胞凋亡的影响 流式细胞术、Western blot结果显示,模型组细胞凋亡率、Bax蛋白表达显著高于正常对照组,Bcl-2蛋白表达显著低于正常对照组(P<0.05);乌梅丸低、中、高剂量组细胞凋亡率、Bax蛋白表达显著低于模型组,Bcl-2蛋白表达显著高于模型组(P<0.05)。见表2、图1。

图1 乌梅丸对UC大鼠结肠细胞凋亡的影响Fig.1 Effect of Wumei Pill on apoptosis of colon cells in UC rats

表2 乌梅丸对UC大鼠结肠细胞凋亡的影响(±s,n=10)Tab.2 Effects of Wumei Pill on apoptosis of colon cells in UC rats (±s,n=10)

表2 乌梅丸对UC大鼠结肠细胞凋亡的影响(±s,n=10)Tab.2 Effects of Wumei Pill on apoptosis of colon cells in UC rats (±s,n=10)

Note:Compared with control group, 1)P<0.05; compared with model group, 2)P<0.01.

Groups Control Model Wumei Pill low dose Wumei Pill medium dose Wumei Pill high dose F P Apoptosis rate/%8.94±0.77 41.76±6.521)30.47±6.732)22.96±5.862)13.28±3.222)279.046 0.000 Bax protein 0.33±0.03 0.90±0.091)0.75±0.072)0.62±0.062)0.53±0.052)152.067 0.000 Bcl-2 protein 0.96±0.09 0.30±0.031)0.55±0.052)0.66±0.062)0.78±0.072)164.083 0.000

2.3 乌梅丸对UC大鼠结肠细胞IL-1β、IL-13含量的影响 ELISA结果显示,模型组细胞IL-1β、IL-13含量显著高于正常对照组(P<0.05);乌梅丸低、中、高剂量组IL-1β、IL-13含量显著低于模型组(P<0.05)。见表3。

表3 乌梅丸对UC大鼠结肠细胞IL-1β、IL-13含量的影响(±s,n=10,ng/L)Tab.3 Effects of Wumei Pill on IL-1β and IL-13 contents in colon cells of UC rats (±s,n=10,ng/L)

表3 乌梅丸对UC大鼠结肠细胞IL-1β、IL-13含量的影响(±s,n=10,ng/L)Tab.3 Effects of Wumei Pill on IL-1β and IL-13 contents in colon cells of UC rats (±s,n=10,ng/L)

Note:Compared with control group, 1)P<0.05; compared with model group, 2)P<0.01.

IL-13 25.97±7.04 92.46±8.991)63.83±7.862)58.94±5.742)28.75±.752)199.047 0.000 Groups Control Model Wumei Pill low dose Wumei Pill medium dose Wumei Pill high dose F P IL-1β 24.66±3.67 89.23±6.711)68.94±6.942)53.96±3.562)36.73±4.582)185.864 0.000

2.4 乌梅丸对UC大鼠结肠细胞miR-146a表达的影响 RT-qPCR结果显示,模型组细胞miR-146a表达显著高于正常对照组(P<0.05);乌梅丸低、中、高剂量组miR-146a表达显著低于模型组(P<0.05)。见表4。

表4 乌梅丸对UC大鼠结肠细胞miR-146a表达的影响(±s,n=10)Tab.4 Effects of Wumei Pill on miR-146a expression in colon cells of UC rats (±s,n=10)

表4 乌梅丸对UC大鼠结肠细胞miR-146a表达的影响(±s,n=10)Tab.4 Effects of Wumei Pill on miR-146a expression in colon cells of UC rats (±s,n=10)

Note:Compared with control group, 1)P<0.05; compared with model group, 2)P<0.01.

miR-146a 1.00±0.10 3.27±0.261)2.81±0.232)2.02±0.192)1.54±0.162)198.958 0.000 Groups Control Model Wumei Pill low dose Wumei Pill medium dose Wumei Pill high dose F P

2.5 抑制miR-146a对UC大鼠结肠细胞增殖和凋亡的影响 anti-miR-146a组细胞存活率、Bcl-2蛋白表达显著高于miR-NC组,细胞凋亡率、Bax蛋白表达、IL-1β、IL-13含量显著低于anti-miR-NC组(P<0.05)。见表5、图2。

图2 抑制miR-146a时凋亡相关蛋白表达Fig.2 Apoptosis-related proteins expressions on miR-146a inhibition

表5 抑制miR-146a对UC大鼠结肠细胞增殖和凋亡的影响(±s,n=10)Tab.5 Effect of inhibition of miR-146a on proliferation and apoptosis of UC rat colon cells (±s,n=10)

表5 抑制miR-146a对UC大鼠结肠细胞增殖和凋亡的影响(±s,n=10)Tab.5 Effect of inhibition of miR-146a on proliferation and apoptosis of UC rat colon cells (±s,n=10)

Note:Compared with anti-miR-NC group, 1)P<0.05.

IL-13/(ng·L-1)89.95±6.14 42.07±4.411)55.001 0.000 Groups anti-miR-NC anti-miR-146a t P Survival rate/%43.96±3.06 91.06±9.141)119.047 0.000 Apoptosis rate/%38.94±5.02 9.05±0.191)94.730 0.000 Bcl-2 protein 0.35±0.04 0.90±0.091)39.005 0.000 Bax protein 0.88±0.08 0.31±0.031)18.037 0.000 IL-1β/(ng·L-1)85.76±7.14 33.45±2.961)47.904 0.000

2.6 过表达miR-146a逆转乌梅丸对UC大鼠结肠细胞增殖和凋亡的影响 乌梅丸+miR-146a组细胞存活率、Bcl-2蛋白表达显著低于乌梅丸+miR-NC组,细胞凋亡率、Bax蛋白表达、IL-1β、IL-13含量显著高于乌梅丸+miR-NC组(P<0.05)。见表6、图3。

图3 过表达miR-146a时凋亡相关蛋白表达Fig.3 Apoptosis-related proteins expressions on miR-146a overexpression

表6 过表达miR-146a逆转乌梅丸对UC大鼠结肠细胞增殖和凋亡的影响(±s,n=10)Tab.6 Overexpression of miR-146a expression reverses effect of Wumei Pill on proliferation and apoptosis of colon cells in UC rats (±s,n=10)

表6 过表达miR-146a逆转乌梅丸对UC大鼠结肠细胞增殖和凋亡的影响(±s,n=10)Tab.6 Overexpression of miR-146a expression reverses effect of Wumei Pill on proliferation and apoptosis of colon cells in UC rats (±s,n=10)

Note:Compared with Wumei Pill+miR-NC group, 1)P<0.05.

IL-13/(ng·L-1)38.96±5.16 97.14±8.811)175.550 0.000 Groups Wumei Pill+miR-NC Wumei Pill+miR-146a t P Survival rate/%92.37±7.66 45.06±10.051)269.046 0.000 Apoptosis rate/%10.58±1.35 41.67±5.671)117.885 0.000 Bcl-2 protein 0.88±0.08 0.26±0.021)104.839 0.000 Bax protein 0.38±0.04 0.94±0.091)116.779 0.000 IL-1β/(ng·L-1)43.60±12.36 95.73±8.991)103.447 0.000

3 讨论

UC是一种慢性非特异性肠道炎症性疾病,临床表现为慢性或亚急性腹泻、黏液脓血便及腹痛等,病因尚未明确,目前认为多因素相互作用所致,一般呈慢性病程,为终生复发性疾病[8-9]。目前研究普遍认为UC是一种多基因靶点参与的疾病,与肠道感染、肠细胞凋亡、免疫功能、炎症反应等相关[10]。肠细胞凋亡与UC病程中肠黏膜损伤有关,Bcl-2和Bax两种基因是细胞凋亡常见标志蛋白,可参与调节线粒体途径凋亡[11]。UC发病时可促进肠细胞释放大量炎症因子,如IL-1β、IL-13、TNF-α等,而IL-1β、IL-13是白细胞家族成员,在UC患者血清内高表达,与UC严重程度密切相关[12]。本研究通过构建UC大鼠模型发现大鼠结肠细胞存活率、Bcl-2蛋白表达降低,而凋亡率、Bax蛋白表达明显升高,并释放大量IL-1β、IL-13,提示UC模型构建成功。

近年中医药治疗UC已表现出独特优势,如芍药内酯苷能抑制UC大鼠模型炎症反应,并减轻结肠组织氧化反应及病变[13];雷公藤多苷可减轻UC大鼠肠黏膜细胞凋亡和炎症反应[14]。乌梅丸主要由乌梅、附子、干姜、细辛、桂枝等组成,始载于《伤寒杂病论》,临床用于UC治疗已获得认可,可通过抑制结肠上皮细胞过度凋亡及炎症因子释放等发挥UC治疗效果[15-16]。研究发现乌梅丸可通过抑制结肠上皮细胞过度凋亡对UC起治疗作用[17]。乌梅丸可抑制UC结肠上皮细胞凋亡起治疗作用[18]。本研究发现乌梅丸处理UC大鼠明显提高细胞存活率、Bcl-2蛋白表达,降低凋亡率、Bax蛋白表达,减少IL-1β、IL-13释放,提示乌梅丸可明显减轻UC大鼠结肠细胞凋亡和炎症反应,与文献[17-18]结果相似。

miR-146a是miRNA,与UC发病密切相关,如雷公藤多苷片通过调控miR-146a抑制大鼠UC[19]。miR-146a可通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路减少炎症因子释放缓解UC症状[20]。安肠汤通过调控miR-146a/IRAK-1轴减轻UC大鼠肠黏膜炎症反应。表明miR-146a有望成为UC的潜在标志物。本研究显示UC模型组细胞miR-146a表达增加,乌梅丸处理后miR-146a表达降低,抑制miR-146a细胞存活率升高,细胞凋亡率、IL-1β、IL-13含量显著降低。过表达miR-146a逆转乌梅丸对UC大鼠结肠细胞增殖和凋亡的影响,说明乌梅丸通过上调miR-146a表达抑制UC大鼠结肠细胞凋亡。

综上,乌梅丸通过上调miR-146a表达降低UC大鼠结肠细胞凋亡,为肠炎治疗提供了依据。

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