乌梅丸通过调控miR-146a对溃疡性结肠炎大鼠结肠细胞凋亡的影响及机制研究

杨雪 储琳 （.泰州市中医院药学部，泰州 5300；.泰州市中医院脾胃病科，泰州 5300）

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种结肠和直肠慢性炎症性疾病，多由遗传、肠道环境、感染等因素共同作用引起，与大肠黏膜及黏膜下层有关，病程漫长，常反复发作、难以治愈［1-2］。UC发病原因尚不明确，其治疗主要以西药控制炎症为主，虽有一定疗效，但易引起较多不良反应［3］。近年中医治疗UC已成为医学研究热点，效果明显［4］。乌梅丸是汉代张仲景《伤寒杂病论》中治疗厥阴病的方剂，临床可用于治疗上热下寒所致头痛、心烦、口干咽燥、腹痛、下痢、呕吐、手足厥冷等，具有缓肝调中、清上温下的作用，临床研究已证明乌梅丸对UC有明显治疗效果［5-6］。微小RNA（miRNA）可参与调节多种基因表达，近年研究显示miRNA与UC发病有关，如炎症性肠病（UC、克罗恩病）患者外周血单个核细胞中miR-146a表达上调，与病情严重程度有关［7］。乌梅丸与miR-146a对UC大鼠模型的影响未见报道，鉴于此，本实验主要探讨乌梅丸通过调控miR-146a对UC大鼠结肠细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 50只SD雄性大鼠，体质量（220.33±20.16） g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK（湘）2020-0002，本研究经泰州市中医院实验动物伦理委员会批准（20220012）。

1.1.2 药物 乌梅丸组成：乌梅16 g、附子6 g、干姜10 g、细辛6 g、桂枝6 g、蜀椒4 g、黄连16 g、黄柏6 g、人参6 g、当归4 g。药物经水浸泡后，常规煎煮、过滤及浓缩。所有药物均购自北京同仁堂有限责任公司。

1.1.3 试剂 DMEM培养基购自美国Sigma公司；胰蛋白酶购自美国Invitrogen公司；CCK-8试剂购自上海碧云天生物技术研究所；胎牛血清购自美国Gibco公司；Trizol试剂购自大连宝生物科技有限公司；凋亡试剂盒购自北京索莱宝生物科技有限公司；ELISA试剂盒购自上海酶联生物技术有限公司；BCA试剂盒购自北京天根生化科技公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与分组 选取50只SD大鼠，每组10只，分为正常对照组（给予10 ml/kg生理盐水）、模型组（TNBS/乙醇灌肠诱导UC形成）、乌梅丸低、中、高剂量组（灌胃13.3、26.6、53.2 g/kg乌梅丸）。UC大鼠结肠细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基于37 ℃、5%CO2培养，细胞融合至80%～90%时，0.25%胰蛋白酶消化传代，取对数生长期细胞进行实验。将anti-miR-NC、anti-miR-146a模拟物分别转染至UC大鼠结肠细胞，作为anti-miR-NC组、antimiR-146a组；将miR-NC、miR-146a分别转染至UC大鼠结肠细胞，乌梅丸干预，作为乌梅丸+miR-NC组、乌梅丸+miR-146a组。

1.2.2 CCK-8检测细胞增殖 每组取1×104个细胞接种于96孔板，贴壁后每孔添加10 μl CCK-8孵育2 h，酶标仪检测450 nm处光密度（OD）值。

1.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡 调整各组细胞浓度为2×105个/ml，取5 μl Annexin V-FITC加入500 μl细胞悬液混合，加入5 μl PI，室温暗室孵育1 h。流式细胞术分析染色情况，计算细胞凋亡率。

1.2.4 RT-qPCR检测miR-146a表达 Trizol试剂提取各组细胞总RNA，分光光度计测定RNA浓度，逆转录试剂盒合成cDNA。SYBR Green PCR Master Mix试剂盒进行扩增，2-ΔΔCt计算miR-146a相对表达。

1.2.5 试剂盒检测细胞IL-1β和IL-13含量 提取细胞上清，ELISA试剂盒检测IL-1β和IL-13含量，严格按说明书操作。

1.2.6 Western blot检测细胞蛋白表达 提取总蛋白，BCA测定蛋白浓度，SDS-PAGE电泳，转至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入一抗4 ℃孵育过夜，加入二抗室温孵育90 min，ECL发光液显影，ChemiDoc XRS+系统成像，Quantity One软件测定各组蛋白条带灰度值。

1.3 统计学分析 采用SPSS22.0软件进行统计学分析，计量资料用±s表示，两组比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 乌梅丸对UC大鼠结肠细胞增殖的影响CCK-8结果显示，模型组细胞存活率显著低于正常对照组（P＜0.05）；乌梅丸低、中、高剂量组细胞存活率显著高于模型组（P＜0.05）。见表1。

表1 乌梅丸对UC大鼠结肠细胞增殖的影响（±s，n=10）Tab.1 Effects of Wumei Pill on proliferation of colon cells in UC rats （±s，n=10）

表1 乌梅丸对UC大鼠结肠细胞增殖的影响（±s，n=10）Tab.1 Effects of Wumei Pill on proliferation of colon cells in UC rats （±s，n=10）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05； compared with model group， 2）P＜0.01.

Survival rate/%96.73±8.11 40.34±6.711）65.45±3.752）72.76±6.362）88.93±9.642）375.775 0.000 Groups Control Model Wumei Pill low dose Wumei Pill medium dose Wumei Pill high dose F P

2.2 乌梅丸对UC大鼠结肠细胞凋亡的影响 流式细胞术、Western blot结果显示，模型组细胞凋亡率、Bax蛋白表达显著高于正常对照组，Bcl-2蛋白表达显著低于正常对照组（P＜0.05）；乌梅丸低、中、高剂量组细胞凋亡率、Bax蛋白表达显著低于模型组，Bcl-2蛋白表达显著高于模型组（P＜0.05）。见表2、图1。

图1 乌梅丸对UC大鼠结肠细胞凋亡的影响Fig.1 Effect of Wumei Pill on apoptosis of colon cells in UC rats

表2 乌梅丸对UC大鼠结肠细胞凋亡的影响（±s，n=10）Tab.2 Effects of Wumei Pill on apoptosis of colon cells in UC rats （±s，n=10）

表2 乌梅丸对UC大鼠结肠细胞凋亡的影响（±s，n=10）Tab.2 Effects of Wumei Pill on apoptosis of colon cells in UC rats （±s，n=10）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05； compared with model group， 2）P＜0.01.

Groups Control Model Wumei Pill low dose Wumei Pill medium dose Wumei Pill high dose F P Apoptosis rate/%8.94±0.77 41.76±6.521）30.47±6.732）22.96±5.862）13.28±3.222）279.046 0.000 Bax protein 0.33±0.03 0.90±0.091）0.75±0.072）0.62±0.062）0.53±0.052）152.067 0.000 Bcl-2 protein 0.96±0.09 0.30±0.031）0.55±0.052）0.66±0.062）0.78±0.072）164.083 0.000

2.3 乌梅丸对UC大鼠结肠细胞IL-1β、IL-13含量的影响 ELISA结果显示，模型组细胞IL-1β、IL-13含量显著高于正常对照组（P＜0.05）；乌梅丸低、中、高剂量组IL-1β、IL-13含量显著低于模型组（P＜0.05）。见表3。

表3 乌梅丸对UC大鼠结肠细胞IL-1β、IL-13含量的影响（±s，n=10，ng/L）Tab.3 Effects of Wumei Pill on IL-1β and IL-13 contents in colon cells of UC rats （±s，n=10，ng/L）

表3 乌梅丸对UC大鼠结肠细胞IL-1β、IL-13含量的影响（±s，n=10，ng/L）Tab.3 Effects of Wumei Pill on IL-1β and IL-13 contents in colon cells of UC rats （±s，n=10，ng/L）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05； compared with model group， 2）P＜0.01.

IL-13 25.97±7.04 92.46±8.991）63.83±7.862）58.94±5.742）28.75±.752）199.047 0.000 Groups Control Model Wumei Pill low dose Wumei Pill medium dose Wumei Pill high dose F P IL-1β 24.66±3.67 89.23±6.711）68.94±6.942）53.96±3.562）36.73±4.582）185.864 0.000

2.4 乌梅丸对UC大鼠结肠细胞miR-146a表达的影响 RT-qPCR结果显示，模型组细胞miR-146a表达显著高于正常对照组（P＜0.05）；乌梅丸低、中、高剂量组miR-146a表达显著低于模型组（P＜0.05）。见表4。

表4 乌梅丸对UC大鼠结肠细胞miR-146a表达的影响（±s，n=10）Tab.4 Effects of Wumei Pill on miR-146a expression in colon cells of UC rats （±s，n=10）

表4 乌梅丸对UC大鼠结肠细胞miR-146a表达的影响（±s，n=10）Tab.4 Effects of Wumei Pill on miR-146a expression in colon cells of UC rats （±s，n=10）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05； compared with model group， 2）P＜0.01.

miR-146a 1.00±0.10 3.27±0.261）2.81±0.232）2.02±0.192）1.54±0.162）198.958 0.000 Groups Control Model Wumei Pill low dose Wumei Pill medium dose Wumei Pill high dose F P

2.5 抑制miR-146a对UC大鼠结肠细胞增殖和凋亡的影响 anti-miR-146a组细胞存活率、Bcl-2蛋白表达显著高于miR-NC组，细胞凋亡率、Bax蛋白表达、IL-1β、IL-13含量显著低于anti-miR-NC组（P＜0.05）。见表5、图2。

图2 抑制miR-146a时凋亡相关蛋白表达Fig.2 Apoptosis-related proteins expressions on miR-146a inhibition

表5 抑制miR-146a对UC大鼠结肠细胞增殖和凋亡的影响（±s，n=10）Tab.5 Effect of inhibition of miR-146a on proliferation and apoptosis of UC rat colon cells （±s，n=10）

表5 抑制miR-146a对UC大鼠结肠细胞增殖和凋亡的影响（±s，n=10）Tab.5 Effect of inhibition of miR-146a on proliferation and apoptosis of UC rat colon cells （±s，n=10）

Note：Compared with anti-miR-NC group， 1）P＜0.05.

IL-13/（ng·L-1）89.95±6.14 42.07±4.411）55.001 0.000 Groups anti-miR-NC anti-miR-146a t P Survival rate/%43.96±3.06 91.06±9.141）119.047 0.000 Apoptosis rate/%38.94±5.02 9.05±0.191）94.730 0.000 Bcl-2 protein 0.35±0.04 0.90±0.091）39.005 0.000 Bax protein 0.88±0.08 0.31±0.031）18.037 0.000 IL-1β/（ng·L-1）85.76±7.14 33.45±2.961）47.904 0.000

2.6 过表达miR-146a逆转乌梅丸对UC大鼠结肠细胞增殖和凋亡的影响 乌梅丸+miR-146a组细胞存活率、Bcl-2蛋白表达显著低于乌梅丸+miR-NC组，细胞凋亡率、Bax蛋白表达、IL-1β、IL-13含量显著高于乌梅丸+miR-NC组（P＜0.05）。见表6、图3。

图3 过表达miR-146a时凋亡相关蛋白表达Fig.3 Apoptosis-related proteins expressions on miR-146a overexpression

表6 过表达miR-146a逆转乌梅丸对UC大鼠结肠细胞增殖和凋亡的影响（±s，n=10）Tab.6 Overexpression of miR-146a expression reverses effect of Wumei Pill on proliferation and apoptosis of colon cells in UC rats （±s，n=10）

表6 过表达miR-146a逆转乌梅丸对UC大鼠结肠细胞增殖和凋亡的影响（±s，n=10）Tab.6 Overexpression of miR-146a expression reverses effect of Wumei Pill on proliferation and apoptosis of colon cells in UC rats （±s，n=10）

Note：Compared with Wumei Pill+miR-NC group， 1）P＜0.05.

IL-13/（ng·L-1）38.96±5.16 97.14±8.811）175.550 0.000 Groups Wumei Pill+miR-NC Wumei Pill+miR-146a t P Survival rate/%92.37±7.66 45.06±10.051）269.046 0.000 Apoptosis rate/%10.58±1.35 41.67±5.671）117.885 0.000 Bcl-2 protein 0.88±0.08 0.26±0.021）104.839 0.000 Bax protein 0.38±0.04 0.94±0.091）116.779 0.000 IL-1β/（ng·L-1）43.60±12.36 95.73±8.991）103.447 0.000

3 讨论

UC是一种慢性非特异性肠道炎症性疾病，临床表现为慢性或亚急性腹泻、黏液脓血便及腹痛等，病因尚未明确，目前认为多因素相互作用所致，一般呈慢性病程，为终生复发性疾病［8-9］。目前研究普遍认为UC是一种多基因靶点参与的疾病，与肠道感染、肠细胞凋亡、免疫功能、炎症反应等相关［10］。肠细胞凋亡与UC病程中肠黏膜损伤有关，Bcl-2和Bax两种基因是细胞凋亡常见标志蛋白，可参与调节线粒体途径凋亡［11］。UC发病时可促进肠细胞释放大量炎症因子，如IL-1β、IL-13、TNF-α等，而IL-1β、IL-13是白细胞家族成员，在UC患者血清内高表达，与UC严重程度密切相关［12］。本研究通过构建UC大鼠模型发现大鼠结肠细胞存活率、Bcl-2蛋白表达降低，而凋亡率、Bax蛋白表达明显升高，并释放大量IL-1β、IL-13，提示UC模型构建成功。

近年中医药治疗UC已表现出独特优势，如芍药内酯苷能抑制UC大鼠模型炎症反应，并减轻结肠组织氧化反应及病变［13］；雷公藤多苷可减轻UC大鼠肠黏膜细胞凋亡和炎症反应［14］。乌梅丸主要由乌梅、附子、干姜、细辛、桂枝等组成，始载于《伤寒杂病论》，临床用于UC治疗已获得认可，可通过抑制结肠上皮细胞过度凋亡及炎症因子释放等发挥UC治疗效果［15-16］。研究发现乌梅丸可通过抑制结肠上皮细胞过度凋亡对UC起治疗作用［17］。乌梅丸可抑制UC结肠上皮细胞凋亡起治疗作用［18］。本研究发现乌梅丸处理UC大鼠明显提高细胞存活率、Bcl-2蛋白表达，降低凋亡率、Bax蛋白表达，减少IL-1β、IL-13释放，提示乌梅丸可明显减轻UC大鼠结肠细胞凋亡和炎症反应，与文献［17-18］结果相似。

miR-146a是miRNA，与UC发病密切相关，如雷公藤多苷片通过调控miR-146a抑制大鼠UC［19］。miR-146a可通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路减少炎症因子释放缓解UC症状［20］。安肠汤通过调控miR-146a/IRAK-1轴减轻UC大鼠肠黏膜炎症反应。表明miR-146a有望成为UC的潜在标志物。本研究显示UC模型组细胞miR-146a表达增加，乌梅丸处理后miR-146a表达降低，抑制miR-146a细胞存活率升高，细胞凋亡率、IL-1β、IL-13含量显著降低。过表达miR-146a逆转乌梅丸对UC大鼠结肠细胞增殖和凋亡的影响，说明乌梅丸通过上调miR-146a表达抑制UC大鼠结肠细胞凋亡。

综上，乌梅丸通过上调miR-146a表达降低UC大鼠结肠细胞凋亡，为肠炎治疗提供了依据。