美沙拉秦介导TGF-β1/Smad信号通路减轻脂多糖诱导的结肠上皮细胞炎症及凋亡

侯静 刘加宁 冯如 陆伟 王云 苏峰 （.徐州医科大学附属宿迁医院消化内科，宿迁 3800；.徐州医科大学附属宿迁医院药学部，宿迁 3800）

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一类慢性炎症性复发性疾病，表现为结肠、直肠黏膜及黏膜下层持续性、融合性炎症反应，临床表现为腹痛、腹泻和便血，严重者可发展为结直肠癌［1］。UC发病较为复杂，主要与地域、遗传、环境、饮食和自身免疫等多种因素相关，随着社会经济不断发展，全球UC发病率持续上升，且研究发现UC可能参与结直肠癌发生及发展，但具体发病机制尚不清楚［2-3］。目前UC主要治疗手段包括药物治疗和手术治疗，治疗初期通常选择药物治疗，而美沙拉秦（Mesalazine，MS）肠溶片是常见UC治疗西药，主要成分为5-氨基水杨酸，具有非甾体类抗炎药效果［4］；重症UC患者则选择手术治疗，过早手术患者会失去保留结肠的机会，过晚又会错过最佳手术时间。MS治疗UC具有显著效果，但MS预防UC的临床证据尚需实验研究证实，且MS治疗UC的作用机制尚未阐明。肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、IL-6及可溶性白细胞介素-2受体（soluble interleukin-2 receptor，sIL-2R）作为被广泛研究的炎症因子，可促进白细胞活化，使肠道黏膜炎症反应持续［5-7］。MAVROPOULOU等［8］证明克罗恩病（Crohn's disease，CD）患者血清IL-6水平和UC患者sIL-2R水平可作为非侵入性生物标志物识别疾病活动状态。

多项研究表明结肠上皮细胞与UC发生相关，其中增殖、凋亡与结肠生长息息相关［9］。TGF-β1/Smad信号通路在UC进程中发挥重要作用，且该通路可作为UC治疗药物靶点［10-11］。MS是否通过介导TGF-β1/Smad通路调节UC的报道较少。因此本研究为探求MS介导的可能机制，构建体外UC细胞模型，研究MS对LPS诱导的结肠上皮细胞生长、增殖和凋亡的影响，明确MS对炎症因子TNF-α、IL-6和sIL-2R表达及TGF-β1/Smad信号通路的调控作用，从分子角度说明MS对UC的治疗作用，为MS临床治疗UC提供重要依据。

1 材料与方法

1.1 材料 人结肠上皮细胞NCM-460购自河南省工业微生物菌种工程技术研究中心；LPS、MS（纯度≥99%，上海源叶生物科技有限公司）；胎牛血清、DMEM-H培养基（美国Gibco公司）；Hoechst 33258染色试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司）；ELISA试剂盒（北京贝博生物科技有限公司）；EdU细胞增殖检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白试剂盒（英国Abcam公司）；鼠抗人TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7、p-Smad2、p-Smad3和β-actin抗体（一抗）、碱性磷酸酶标记的山羊抗鼠IgG（二抗）（美国CST公司）；MF52-N型倒置荧光显微镜（广州市明美光电技术有限公司）；Multiskan FC酶标仪（美国Thermo公司）；OI 1000型凝胶成像系统（广州光仪生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 KEGG信号通路富集分析 使用KEGG数据库（https：//www.kegg.jp/pathway/）对炎症性肠病细胞相关通路进行分析，物种选择“human”。

1.2.2 人结肠上皮细胞NCM-460培养 人结肠上皮细胞NCM-460在37 ℃、5%CO2条件下培养，培养基选用DMEM-H培养基（补加10%胎牛血清），待细胞贴壁达80%以上时进行传代，取第4代对数生长期细胞用于后续实验。

1.2.3 细胞分组与给药 细胞分为Con组、LPS组、MS组（0.1、0.2、0.4 mg/L MS）和inhibitor组，Con组细胞不加药物干预，LPS组加入1 mg/L LPS诱导24 h构建UC细胞模型，MS组分别采用0.1、0.2、0.4 mg/L MS干预LPS组细胞，inhibitor组在0.2 mg/L MS组基础上添加10 μmol/L LY2109761进行干预，每组3个重复。

1.2.4 细胞形态学观察 将各组药物干预24 h的NCM-460细胞置于倒置显微镜下观察形态并拍照记录。

1.2.5 EdU法测定NCM-460细胞增殖率 取各组干预48 h的细胞进行EdU处理，去除培养液，0.5 ml 4%多聚甲醛室温固定15 min，0.5 ml 3%BSA洗涤3次；0.5 ml 0.3%TritonX-100室温去除BSA 10 min，BSA洗涤3次；12孔板中每孔加200 μl Click反应液（现配现用），室温避光孵育30 min，3%BSA洗涤3次去除Click反应液；每孔加入0.5 ml Hoechst，室温避光孵育10 min；3%BSA洗涤3次去除Hoechst；装片，荧光显微镜拍照，Image J软件处理图片。以EdU阳性染色细胞（红色）占总细胞（蓝色）的百分比表示细胞增殖率。

1.2.6 Hoechst 33258染色测定NCM-460细胞凋亡 PBS缓慢清洗药物干预24 h的NCM-460细胞2次，5 min/次；4%多聚甲醛（现用现配） 4 ℃固定10 min；PBS洗涤3次（5 min/次），5 mg/L Hoechst 33258染色液染色10 min，PBS清洗3次（5 min/次），封固后荧光显微镜观察细胞凋亡情况，随机选择3个视野拍照。

1.2.7 ELISA试剂盒检测NCM-460细胞培养液中炎症因子水平 收集各组干预24 h后的细胞上清，分别按照TNF-α、IL-6和sIL-2R ELISA试剂盒说明书操作，测定炎症因子TNF-α、IL-6和sIL-2R释放量。细胞培养液离心收集上清，分别将100 μl标准品及待测上清加入酶标板，37 ℃孵育2 h，弃上清；加100 μl生物素化抗体工作液和酶结合物工作液37 ℃孵育1 h；洗涤后用90 μl底物溶液37 ℃孵育10 min；加入50 μl终止液，5 min内测量各孔450 nm处OD值。

1.2.8 Western blot测定NCM-460细胞中TGF-β1/Smad通路相关蛋白表达 干预24 h后，收集各组细胞于RIPA液冰上裂解，4 ℃、12 000 r/min离心20 min，取上清进行蛋白变性，制胶，上样，SDS-PAGE凝胶电泳，100 mA恒流转PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭2 h，参照抗体说明加入一定比例稀释的一抗（TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7、p-Smad2、p-Smad3和β-actin），再加碱性磷酸酶标记的山羊抗鼠IgG二抗稀释液，显影，一抗孵育2～3 h，二抗孵育2 h，分别用TBST洗涤3次，凝胶成像系统拍照记录。蛋白灰度值用G表示，蛋白相对表达量=G目的蛋白/G内参蛋白（β-actin）。

1.3 统计学分析 采用SPSS23.0软件进行统计学分析。多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。GraphPad Prism 8.0软件作图，Image J软件计算EdU增殖细胞数、总细胞数和蛋白灰度值。

2 结果

2.1 TGF-β1/Smad通路及炎症因子选择 使用KEGG PATHWAY数据库对人炎症性肠病细胞进行通路富集分析（图1），TGF-β可间接抑制炎症性肠病、参与CD发生，UC属于炎症性肠病的一种，因此选择TGF-β通路进行研究。人炎症性肠病细胞中TGF-β通路直接调控下游Smad2/3基因，通过磷酸化发挥作用，Smad7可抑制Smad2/3蛋白表达（图2），因此选择TGF-β及下游Smad2/3、Smad7基因进行研究。炎症因子TNF-α和IL-6与炎症性肠病发生相关（图1），且MAVROPOULOU等［8］证明UC患者sIL-2R水平可作为非侵入性生物标志物识别疾病活动状态，所以本研究选择IL-6、TNF-α和sIL-2R炎症因子进行实验。

图1 人类炎症性肠病相关信号通路图Fig.1 Signaling pathways associated with human inflammatory bowel disease

图2 人炎症性肠病中TGF-β信号通路图Fig.2 TGF-β signaling pathway in human inflammatory bowel disease

2.2 MS对人结肠上皮NCM-460细胞形态学的影响 人结肠上皮NCM-460细胞经LPS诱导24 h后，细胞生长受到抑制；0.1、0.2、0.4 mg/L MS处理LPS组细胞24 h后，细胞生长抑制能力下降，轮廓逐渐清晰，贴壁能力增强，Inhibitor组细胞生长趋势和形态变化与MS组细胞相同（图3）。

图3 倒置显微镜观察NCM-460细胞形态学变化（×20）Fig.3 Morphological changes of NCM-460 cells observed by inverted microscope （×20）

2.3 MS促进NCM-460细胞增殖 LPS处理24 h后，EdU阳性细胞数比Con组明显减少，提示LPS处理降低NCM-460细胞增殖率（图4）；与LPS组相比，随着MS浓度增加，细胞增殖率逐渐升高，其中0.2和0.4 mg/L MS增加显著（P＜0.05）；与0.2 mg/L MS组相比，抑制剂进一步提升细胞增殖率（P＜0.05）。

图4 EdU检测NCM-460细胞增殖情况（×20）Fig.4 NCM-460 cell proliferation detected by EdU assay （×20）

2.4 MS抑制NCM-460细胞的凋亡 正常细胞核呈淡蓝色，形态呈圆形，凋亡细胞核呈亮蓝色。LPS处理24 h后，LPS组细胞与Con组相比，凋亡细胞数明显增加；与LPS组相比，MS组细胞凋亡数随着处理浓度增加逐渐减少，而Inhibitor组细胞凋亡数进一步减少（图5）。

图5 荧光倒置显微镜下观察NCM-460细胞凋亡（×40）Fig.5 NCM-460 cells apoptosis observed under fluorescent inverted microscope （×40）

2.5 MS抑制NCM-460细胞炎症 ELISA检测不同处理组NCM-460细胞培养液中TNF-α、IL-6和sIL-2R表达（图6），与Con组相比，LPS组细胞炎症因子TNF-α、IL-6及sIL-2R表达均显著升高；MS处理后，炎症因子水平逐渐降低，呈剂量依赖性（P＜0.05）；与0.2 mg/L MS组相比，抑制剂进一步降低炎症因子表达（P＜0.05）。

图6 ELISA检测NCM-460细胞炎症因子释放量Fig.6 Release of inflammatory factors from NCM-460 cells by ELISA

2.6 MS抑制NCM-460细胞TGF-β1/Smad通路活化 Western blot测定不同处理组NCM-460细胞TGF-β1、Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3和Smad7表达（图7），各组Smad2和Smad3蛋白表达无显著差异（P＞0.05）。与Con组相比，LPS组细胞Smad7表达显著减少，而TGF-β1、p-Smad2和p-Smad3蛋白表达显著增加；与LPS组相比，MS组细胞Smad7表达显著升高，而TGF-β1、p-Smad2和p-Smad3蛋白表达显著降低，且呈剂量依赖性（P＜0.05）；与0.2 mg/L MS组相比，Inhibitor组Smad7表达显著升高，而TGF-β1、p-Smad2和p-Smad3蛋白表达显著降低。

图7 Western blot检测NCM-460细胞TGF-β1/Smad通路相关蛋白表达Fig.7 TGF-β1/Smad pathway-related proteins expressions in NCM-460 cells detected by Western blot

3 讨论

UC是一种常见的消化道疾病，病程较长，极难治愈，具有易复发、治疗病程长等特点，且极易恶化发展为结直肠癌［12］。最近报道指出UC在我国乃至全世界发病率逐年上升，因此，对UC发病机制的研究及治疗方法的探讨成为医疗卫生界重要课题。多数研究者认为该病主要由促炎因子（TNF-α、IL-6等）以及抗炎因子不平衡导致，临床一般选用药物消除炎症反应，而MS作为治疗UC的常见药物，能有效抑制炎症介质白三烯形成、肠壁组织炎症反应和机体肠道病菌炎症递质，清除氧自由基，改善机体或血小板活化因子活性状况，从而改善UC患者临床症状［13-15］。为探求MS介导的可能新机制，本研究探讨其对结肠上皮细胞NCM-460功能、炎症及TGF-β1/Smad信号通路的影响，发现MS可能通过降低TGF-β1/Smad通路活性抑制其凋亡和炎症。

研究表明LPS能够诱发促炎因子表达从而引发炎症。李迪等［16］利用LPS诱导的小鼠BV-2小胶质细胞构建炎症细胞后IL-6释放量显著增加，而郝浩扬等［17］发现LPS诱导的小鼠乳腺组织中TNF-α显著增加，与本研究结果一致。本研究发现LPS诱导人结肠上皮细胞NCM-460增殖受到抑制，凋亡增加，且炎症因子TNF-α、IL-6、sIL-2R水平升高。祝斌等［18］研究发现，葡萄糖硫酸钠诱导的小鼠UC模型中，MS可能通过T细胞亚群发挥抗炎及治疗UC作用；耿艳丽等［19］研究表明MS治疗后UC患者症状显著减轻，且体内TNF-α、IL-6、IL-1β水平显著低于治疗前，证实了MS对UC的治疗作用。本研究利用不同浓度MS处理细胞，发现随着MS浓度增加，NCM-460细胞增殖率升高，细胞凋亡率降低，且TNF-α、IL-6、sIL-2R表达呈浓度依赖性降低，说明MS能够保护NCM-460细胞免受LPS伤害，促进NCM-460细胞生长。

TGF-β1/Smad信号通路能够参与机体发育过程中的细胞生长、分化、凋亡和细胞动态平衡过程，且与炎症性肠病相关［20-21］。陶鹏宇等［22］研究表明TGFβ1/Smad信号通路可能是六味地黄丸减轻糖尿病肾病炎症损伤的机制之一。于芝等［23］研究发现右美托咪定通过抑制TGF-β1/Smad信号通路激活减轻炎症对人软骨细胞的损伤作用。本研究发现LPS诱导的细胞中Smad7蛋白表达明显下降，而TGF-β1、p-Smad2和p-Smad3蛋白表达显著增加，表明LPS组细胞TGF-β1/Smad信号通路被激活；而MS组和抑制组细胞Smad7蛋白表达显著升高，而TGF-β1、p-Smad2和p-Smad3蛋白表达显著降低，说明MS可通过抑制TGF-β1/Smad信号通路发挥其抗炎作用。

综上，MS通过抑制TGF-β1/Smad信号通路从而减轻LPS诱导的细胞炎症反应和促凋亡作用，抑制UC细胞增殖，促进NCM-460细胞生长。