抑制hsa_circRNA6448-14表达对人食管鳞状细胞癌细胞系KYSE30及KYSE150侵袭迁移的影响

王平，李梦辉，张耀文

1 河南科技大学临床医学院放疗科，河南洛阳 471003；2 河南科技大学第一附属医院；3 安阳市肿瘤医院河南科技大学附属安阳肿瘤医院放疗科；4 河南省食管癌精准防治医学重点实验室

食管癌是河南常见的恶性肿瘤之一，其中以食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）最常见[1］。ESCC 的病死率极高，发病机制至今尚未完全明确[2］。因此，寻找ESCC 早诊早治的分子标志物对改善患者的预后具有重要意义。环状RNA（circular RNA，circRNA）是一种内源性非编码RNA，可通过调控天然小RNA（microRNAs，miRNAs）活性，参与结合转录调控元件及转录蛋白互作基因等过程[3］，且具有结构稳定、种类丰富、特异性强、序列保守等特点。circRNA 具有海绵体机制，可与RNA 分子相互作用，竞争性吸附MicroRNAs（miRNAs），通过调节miRNA 的活性来影响细胞的增殖、分化、凋亡等生理过程。circRNAs 既可以作为癌基因促进肿瘤的发生发展，又可以作为抑癌基因抑制肿瘤的发生发展，同时circRNA 已被证实可作为肝癌、胃癌、肺癌等多种恶性肿瘤的生物标志物用于疾病的诊断和预后判断[4-5］。最新研究[5］发现，ESCC 组织中的circRNA 可作为miRNA 海绵，诱导ESCC 细胞的上皮-间充质转化，调控靶基因表达，促进ESCC 细胞的增殖、侵袭及迁移。我们前期研究[6-7］发现，ESCC 组织和细胞中hsa_circRNA6448-14表达升高，且hsa_circRNA6448-14表达与ESCC分化程度、pTNM 分期呈负相关，与患者的低位生存期呈正相关。为进一步研究hsa_circRNA6448-14 与ESCC 的恶性生物学行为的关系，2022年8月—2023年10 月，我们观察了抑制hsa_circRNA6448-14 表达对人ESCC细胞系KYSE30及KYSE150侵袭、迁移的影响，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂与仪器 ESCC 细胞系KYSE30 及KYSE150（本实验室冻存）。1640 培养基及胎牛血清（美国Gibco 公司）；Lipofectamine2000 转染试剂（美国Invitrogen 公司）；hsa_circRNA6448-14-siRNA（干扰hsa_circRNA6448-14 表达）及siNC（上海吉玛基因公司）；hsa_circRNA6448-14 上游引物为5'-CCAATGGGGACTGTCATGGA-3'，下 游 引 物 为5'-TCATGCCGTGTTTCAGCTCA-3'，GAPDH 上游引物为5'-GTGGAGTCCACTGGCGTCT-3'，下游引物为5'-GTGCAGGAGGCATTGCTGAT-3'（中 国Sangon Biotech 公司）；TRIzol 试剂盒（美国Thermo 公司）；反转录试剂盒及qPCR 试剂盒（中国Vazyme 公司）；PBS缓冲液、4%细胞固定液及1%结晶紫染液（中国Solarbio 公司）；Matrigel 胶（美国Sigma-Aldrich 公司）。荧光定量PCR 仪（美国伯乐公司）；成像系统（美国Thermo 公司）；倒置光学显微镜（日本尼康公司）。

1.2 抑制hsa_circRNA6448-14 表达的KYSE30、KYSE150 细胞构建 常规培养KYSE30 及KYSE150细胞，将细胞各分为2组：对照组（siNC 空白质粒组）及敲降组（siRNA 干扰质粒组），分组如下：KYSE30对照组、KYSE150 对照组、KYSE30 敲降组和KYSE150 敲降组。待各组细胞密度为70%时，根据说明书分别将siNC 及hsa_circRNA6448-14-siRNA与Lipofectamine2000 转染试剂混合，对照组细胞转染siNC 转染混悬液进行，敲降组细胞转染hsa_circRNA6448-14-siRNA 转染混悬液进行。转染48 h时采用qRT-PCR 检测各组细胞hsa_circRNA6448-14，具体步骤参考说明书及文献[7］。KYSE30 敲降组、KYSE30 对照组、KYSE150 敲降组及KYSE150 对照组hsa_circRNA6448-14 相对表达量分别为0.23 ±0.01、1.00 ± 0.05、0.25 ± 0.01、1.02 ± 0.03，与对照组比较，敲降组细胞hsa_circRNA6448-14 的相对表达量低（P均＜0.05），表明成功培养出抑制hsa_circRNA6448-14 表 达 的KYSE30、KYSE150 细胞，可用于后续实验。

1.3 各组细胞侵袭情况观察 采用Transwell 实验。取“1.2”中各组细胞，于无胎牛血清的1640 培养基中饥饿培养24 h。采用Matrigel胶（50 mg/L）包被Transwell 小室基底膜，并于Transwell 下室加入含10%胎牛血清的1640。取各组饥饿培养后的细胞100 μL（含1 × 105个细胞），分别加入Transwell 小室。培养24 h 后，取出Transwell 小室，并擦去内层细胞。将小室外层细胞于PBS缓冲液清洗、4%细胞固定液固定、1%结晶紫染液染色后，对外层细胞进行拍照并计数[8］。均选10个视野，采用Image J 软件测算各组穿膜细胞数（代表侵袭能力），实验重复3次，取平均值。

1.4 各组细胞迁移情况观察 采用划痕实验。取“1.2”中各组细胞，于6 孔板中常规培养，待细胞密度为70%后，采用无菌枪头（200 μL）进行划痕。PBS 缓冲液清洗后更换为新鲜培养基（含10%胎牛血清的1640培养基），常规培养。每隔 6 h 拍照并记录一次细胞迁移面积。细胞迁移面积测量软件及计算方法参照文献[8］。应用Image J 软件测量不同时间点划痕内空白面积的大小，计算迁移面积，比较两组细胞不同时间点迁移面积的大小，实验重复3次，取平均值。

1.5 统计学方法 采用GraphPad 8.0 统计软件。采用K-S 检验进行正态分析，符合正态分布的计量资料以±s表示，两组间比较采用t检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组穿膜细胞数比较 培养24 h 时 KYSE30敲降组、KYSE30 对照组、KYSE150 敲降组及KYSE150 对照组穿膜细胞数分别为58.00 ± 3.61、161.33 ± 4.06、69.00 ± 2.08、191.33 ± 6.39。与对照组比较，培养24 h 时敲降组细胞穿模细胞数小（t分别为19.04、18.21，P均＜0.05）。

2.2 各组细胞迁移面积比较 培养24 h 时KYSE30 敲降组、KYSE30 对照组、KYSE150 敲降组及KYSE150 对照组细胞迁移面积分别为（11.67 ±0.88）、（26.00 ± 1.73）、（14.33 ± 0.88）、（28.00 ±1.53）mm2。与对照组比较，培养24 h 时敲降组细胞迁移面积小（t分别为7.37、7.75，P均＜0.05）。

3 讨论

中国占食管癌全球病例的50%以上，ESCC 是主要的组织学类型。ESCC 的高危因素有吸烟、饮酒、饮食习惯、遗传易感性、免疫功能紊乱等，目前，ESCC 的主要治疗策略包括手术切除、放疗、化疗和靶向疗法。其中，手术切除是早期ESCC 的首选治疗方法。然而，由于多数ESCC 在诊断时已经进展到晚期，因此，手术切除的效果受限。ESCC 的发生是一个多步骤、多阶段的过程，涉及到基因突变、表观遗传改变、微环境改变和免疫逃逸等多个层面，但具体病因尚未明确。随着对ESCC 分子机制的深入了解，一些新的靶向疗法也正在开发中，如针对EGFR、VEGF 和PD-L1 的抗体药物[9］。但由于ESCC起病隐匿，5 年生存率仍极低，因此，继续寻找ESCC的诊断标记物和治疗靶点至关重要。

circRNA 是一组内源性非编码RNA，具有稳定的共价闭环结构，与线性RNA 相比，这一特性使得它们对RNA 核酸外切酶具有抗性。它们在细胞中的表达具有组织特异性、发育阶段依赖性和疾病相关性，circRNA 可以通过调控基因表达来影响肿瘤的发展。circRNA 可以作为miRNA 的“海绵”，与miRNA 结合形成circRNA-miRNA 复合物，从而释放出miRNA 的靶基因，影响靶基因的表达水平。这种调控机制可以影响肿瘤相关基因的表达以及细胞的增殖、转移和侵袭能力，从而影响肿瘤的发展[15］。甲状腺癌中，has_circRNA0058124可通过miR-218-5p/NUMB 调控NOTCH3/GATAD2A 轴促进癌细胞侵袭及转移，且显著缩短患者生存期[16］；前列腺癌中，circCSNK1G3 可通过调控miR-181 促进癌细胞恶性增殖，降低其治疗敏感性[17］；肝癌中，circASAP1 可通过调控miR-326/miR-532-5P-MAPK1 信号通路促进癌细胞远处转移，引起患者耐药及复发[18］；非小细胞肺癌中，circFGFR1 可通过miR-381-3P 诱导CXCR4高表达，引起癌细胞抵抗凋亡，导致其免疫逃逸[19］；胃癌中，hsa_circ_0001725可通过miR-150-5P/c-Myc 轴参与胃癌的发生发展，hsa_circ_001852通过海绵样吸附miR-139-5p 增加CCT5 基因表达促 进 胃癌恶性进展[20］，hsa circ 0014606 亦可通过miRNA-194- 5p 上调YAP1 基因的表达，发挥促进肿瘤增殖、迁移以及侵袭功能。骨肉瘤中，circMYO10可通过miR-370-3P/RUVBL1 轴引起染色质重塑，增强β-catenin/LEF1 转录活性，促进癌细胞上皮间质转化，导致其恶性转移[21］。肝内胆管细胞癌中，hsa_ circ_002174 充当海绵来调节miR-149 的表达，进而调节Oct-2/IL-16信号通路促进肝内胆管细胞癌的恶性进展[22］。肾细胞癌中，Circ 0008717作为ceRNA海绵作用于miR-217，减少其对FBX017 表达的抑制作用，从而促进肾细胞癌的进展[23］。综上，circRNA的表达水平可以作为人类各种肿瘤的诊断和预后指标，为肿瘤的治疗提供重要依据。

circRNA 在ESCC 发生发展中扮演着重要角色。其中充当miRNA-7（miR-7）海绵的环状RNA-7（ciRS-7），也称CDR1as，在食管癌中研究中最为多见。既往报道称miRNA-7 具有肿瘤抑制因子作用，可通过多种作用机制抑制不同肿瘤类型的进展，包括迁移、侵袭以及上皮间质转化等[19］。ciRS-7含有超过70 个miR-7 的结合位点，能够有效地吸附miR-7，抑制miR-7 功能并上调相关基因的表达，如RS2 和EGFR[20］，解除miR-7 对其靶基因的抑制作用，从而促进肿瘤的发展。在ESCC 中，ciRS-7 不仅可通过miR-7 激活NFκB/p65 通路促进ESCC 细胞生长，还可通过miR-7 激活KLF4 促进ESCC 细胞迁移[21-22］。circ_0000654 可通过miR-149-5P 激活IL-6/STAT3通路诱发炎症反应，降低ESCC 细胞的放疗敏感性[23］。本团队前期研究发现hsa_circRNA6448-14高表达的ESCC 患者生存期缩短[6-7］，包括总生存期（OS）与无进展生存期（PFS），提示预后不良，表明hsa_circRNA6448-14 参与了ESCC 的发生发展。为了进一步探讨hsa_circRNA6448-14 表达情况对ESCC 细胞生物学行为的影响，本研究建立hsa_circRNA6448-14 敲 降 的ESCC 细 胞 系（KYSE30 及KYSE150 细胞系），采用Transwell 细胞侵袭实验及划痕实验检测亲本与敲降细胞系的体外侵袭及迁移能力。结果表明，与亲本细胞系相比，hsa_circRNA6448-14 敲降的ESCC 细胞系的体外侵袭及迁移能力均显著减弱，提示靶向hsa_circRNA6448-14可有效抑制ESCC 细胞的恶性侵袭及远处迁移，表明hsa_circRNA6448-14 为ESCC 细胞侵袭及迁移过程中的关键调控因子。以往的研究表明，circRNA的功能主要是作为海绵吸附miRNA，从而调节靶基因的表达。因此，笔者推测hsa circRNA6448-14 也可能作为海绵调节miRNA，参与ESCC 的发生发展。后续实验计划通过研究circRNA/miRNA 轴，初步探索hsa circRNA6448-14在ESCC中的作用机制。

综上所述，抑制hsa_circRNA6448-14 表达后KYSE30 及KYSE150 细胞的侵袭迁移能力均降低，hsa_circRNA6448-14 可能在ESCC 细胞的侵袭及迁移过程中发挥重要作用，靶向hsa_circRNA6448-14可能是ESCC治疗的新方法。