干细胞治疗椎间盘退变的研究进展

张蒯祥,杨江佳,殷建林,郝洋,章菲凡,李记天,,*

[1.河南省洛阳正骨医院(河南省骨科医院),河南 郑州 450016;2.湖南中医药大学,湖南 长沙 410000;3.河南中医药大学,河南 郑州 450046]

椎间盘退变(intervertebral disc degeneration,IDD)是临床常见的椎间盘病理改变,IDD的发生给社会劳动力带来了沉重负担,同时也对患者家庭经济造成一定的影响[1]。椎间盘由髓核(nucleus pulposus,NP)、纤维环和软骨终板构成,是脊柱运动和负荷的结构支撑,其主要特点为：无血管、缺氧、低糖、低PH、高渗和机械负荷。IDD的原因复杂多样,主要包括衰老、机械压力、遗传因素、缺乏锻炼、吸烟、肥胖、感染、创伤等。IDD主要表现为椎间盘高度的降低、纤维环出现裂隙或断裂、NP中胶原蛋白和水分的丢失、椎体终板的钙化等结构的改变,继而出现椎间盘膨出、突出、脱出等病理变化,并在相应部位出现疼痛、麻木等临床表现。研究表明,退化的椎间盘可以产生大量炎症因子,炎症因子的产生同时又可以进一步加剧IDD的进程[2-3]。因此,在某种程度上,IDD治疗可能存在一些困难。目前,IDD的治疗方法主要包括保守治疗和手术治疗两种。在保守治疗中,主要是通过相应的物理疗法(牵引、理疗、推拿等)、药物治疗(中药熏蒸、非甾体消炎药、肌肉松弛药物、改善微循环的药物等)及康复训练(腰背肌功能锻炼)等方式来缓解患者的疼痛、改善生活质量等。而手术治疗主要是通过椎间盘切除术或植入人工椎间盘等方式来治疗。然而,保守治疗虽然具有创伤小、患者痛苦相对较小、费用低和患者易于接受等优势,但其疗效不稳定且适用范围也相对较窄。传统的手术治疗方法虽然见效快但也存在着创伤大、后遗症多等不利因素。因此需要寻求一种新方法延缓IDD的进展,甚至逆转IDD的进程。

干细胞具有良好的自我更新和分化能力,在实验室研究和临床治疗中具有广泛的应用前景。研究表明干细胞可以通过特定的分化途径修复退变的椎间盘,临床研究证实干细胞疗法治疗疼痛性脊柱疾病具有确切疗效[4-5],研究者认为通过干细胞治疗来激活退变椎间盘的自我修复对于临床治疗IDD至关重要。本文对于干细胞在IDD治疗中可能发挥的作用及机制进行综述,为后续干细胞在IDD治疗中的应用提供参考。

1 干细胞治疗IDD的理论基础

IDD通常是由椎间盘内分解和合成过程的不平衡引起的,NP中促进合成代谢的脊索细胞凋亡后致使椎间盘合成不足,进而导致IDD的发生。因此,修复受损的髓核细胞是治疗IDD的方法之一。

干细胞是具有多向分化潜能、自我更新能力的细胞,是处于细胞系起源顶端的最原始细胞,在体内能够分化产生某种特定组织类型的细胞,其修复椎间盘的机制主要是：(1)分化为髓核细胞,修复椎间盘。修复椎间盘的核心在于修复髓核细胞,当正常的髓核细胞受到损伤后,其增殖的潜力有限。研究人员已将干细胞体外诱导分化为髓核样细胞,可以有效地改善IDD。Binch等[6]成功将人脂肪来源的间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)定向分化为髓核细胞来治疗IDD。Daly等[4]通过实验用MSC促进羊椎间盘切除术模型的腰椎间盘恢复。椎间盘中具有多种生长因子可通过自分泌、旁分泌及内分泌途径促进MSC向NP分化,同时MSC向NP分化还受到细胞共培养、低氧、三维生物支架、应力变化等影响[7-10]。因此,可通过特定的方式诱导干细胞分化为髓核细胞来修复退变的椎间盘。(2)改善疼痛,调节椎间盘的内环境。干细胞具有分泌多种细胞因子的能力,例如生长因子、营养因子、抑炎因子等。其中,生长因子可诱导退变的椎间盘细胞再生,例如胰岛素样生长因子能够促进髓核细胞蛋白聚糖及Ⅱ型胶原表达从而对NP基质合成有促进作用[11],成纤维细胞生长因子在退变的纤维环修复过程中有促进作用[12];营养因子可为细胞的合成生长以及细胞外基质合成提供营养支持;抑炎因子可抑制炎症反应减缓IDD的进程,促进免疫调节,从而改善内环境,缓解疼痛等临床症状[13]。黄晓东等[5]的实验结果表明在大鼠非压缩性椎间盘突出模型中,骨髓MSC可通过抑制小胶质细胞的活化来减轻神经根性疼痛,并能够下调促炎细胞因子的表达。(3)增加血供,改善椎间盘功能。椎间盘本身没有血液供应,一旦受到损伤,很难进行自我修复。张夏梦等[14]通过动物实验发现,当椎动脉型颈椎病模型动物接受耳缘静脉注射骨髓MSC混悬液后,骨髓MSC能上调CD4+CD25+调节性T细胞水平,从而有效抑制椎动脉血管炎症反应,修复受损椎动脉血管。受损椎动脉血管的恢复,有利于IDD得到更大程度改善,缓解椎间盘的进一步恶化。

2 干细胞治疗IDD的现状

2.1 单纯使用干细胞治疗IDD的现状

研究表明,在治疗IDD中,干细胞可以有效修复受损的椎间盘组织,从而改善椎间盘功能[4]。干细胞治疗较传统的治疗方法而言,具有操作简单、治疗效果持久等优点。MSC可以用于IDD,参与缓解疼痛[15]以及术后预防进一步退变、减少并发症[16]等。在MSC的供体来源上,有研究者选用自/异体MSC或干细胞外囊泡治疗IDD,均有良好的治疗效果。Besalti等[16]证明应用自体MSC治疗IDD术后预后不良是一种很有前途的方法;Orozco等[17]针对10例IDD患者进行自体骨髓MSC移植,通过随访,并对其疼痛评分和残疾指数进行评估,发现患者的疼痛和残疾都有所改善。Wang等[18]实验结果表明,自体MSC-陶瓷复合材料在恒河猴体间融合模型植入3个月后,促进骨再生,实现脊柱骨性融合;Xuan等[19]研究表明,椎间盘切除术联合自体椎间盘源性细胞移植治疗腰椎间盘突出是安全可行的。椎间盘源性细胞移植可以减缓原有IDD的加重,减少椎间盘切除术的并发症。Noriega等[20]研究表明,异体MSC治疗可能是治疗IDD的有效选择,异体MSC治疗IDD的优点是：干预简单,无需手术,可以缓解疼痛,并通过观察Pfirrmann分级变化发现其可显著改善IDD。骨髓MSC通过分泌多种生物活性分子来应对局部微环境中的刺激,Distefano等[21]研究表明可以不用外源性干细胞移植而采用人MSC来源的胞外囊泡从而实现椎间盘的无细胞生物活性修复。骨髓MSC可能受到受体的环境改变影响其功能,而干细胞来源的胞外囊泡的因其具有稳定性高等特点,其治疗效果更具有可预测性及可控性。这种MSC胞外囊泡的治疗策略可能通过刺激细胞增殖、促进细胞迁移、保护细胞免受退行性促炎微环境的影响来实现的。Wang等[22]研究证实人骨髓MSC来源的细胞外囊泡通过SOX4/Wnt/β信号通路促进退化的髓核细胞的增殖和细胞外基质的合成。外泌体属于细胞外囊泡的一种,Xiang等[23]研究也证实,人尿源性干细胞外泌体通过蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)和细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)信号通路显著抑制压力条件下内质网应激诱导的细胞凋亡和IDD。因此,这是一种可行的治疗策略。总之,无论是自体干细胞、异体干细胞还是干细胞外囊泡都是治疗IDD的可行方法。

2.2 干细胞与生物载体等联合应用治疗IDD

利用生物支架和MSC联合应用可修复椎间盘缺损,促进其再生。Ukeba等[24]研究表明超纯化干细胞与原位形成的生物可吸收凝胶的结合可促进退变椎间盘的修复,干细胞和凝胶联合增强了严重IDD绵羊模型椎间盘切除术后(长达24周)椎间盘的再生。徐宝山等[25]研究发现使用富含骨髓基质细胞的明胶海绵修复腰椎椎间盘切除术后的椎间盘缺损是可行和有效的,因此这值得作为椎间盘修复的细胞疗法进行进一步的研究和开发。Guillaume等[26]研究发现增强形状记忆藻酸盐-胶原复合支架具有增强细胞迁移和增殖的优势,可用于增强组织修复。梯度三维细胞包埋水凝胶作为椎间盘组织工程的潜在生物支架,具有与天然椎间盘相似的结构和功能：内部区域模仿NP组织,外部区域模仿层状纤维环组织,与干细胞联合应用或能更好的修复椎间盘。研究发现,干细胞的迁移迹象受到哺乳动物椎间盘中细胞外基质结构的影响[27],这对于开发治疗IDD的组织工程时是有用的。不过,目前对于这方面的报道较少,开发相关的生物材料需要进一步研究。

研究表明,端粒酶缩短、DNA损伤、氧化应激、微环境和外泌体等因素会诱导干细胞衰老而不利于椎间盘退行性疾病的治疗[28-29]。因此可以通过药物与干细胞联合应用通过改变椎间盘微环境或提高MSC来源的细胞外囊泡在特定病变微环境中的输送效率等方式提高干细胞治疗能力[30]。左睿等[31]研究发现,炎性细胞因子中的肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α可增加细胞内活性氧的水平,引起软骨终板干细胞衰老和成骨分化;雷帕霉素诱导的自噬增强核因子E2相关因子2(nuclear factor E2 related factor 2,Nrf2)/Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1)信号传导,促进抗氧化蛋白超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)1和 SOD2的表达,从而消除活性氧,缓解干细胞衰老,减少软骨终板干细胞的成骨分化,保护了软骨终板干细胞免受TNF-α诱导的氧化应激和细胞衰老的影响。刘建军等[32]研究表明,酸性条件可以显著抑制细胞增殖,增加细胞凋亡。基因表达结果也表明,酸性条件可降低干细胞相关基因的表达,抑制细胞外基质的合成,并可增加酸敏感离子通道的表达。因此,在IDD的酸性条件下可以抑制NP中MSC的生物学行为,阿米洛利可以通过提高NP中MSC的活性来改善IDD。王子玉等[33]研究证实Sa12b(一种黄蜂肽)通过抑制酸敏感离子通道,提高严重酸性环境下退变NP中MSC的生物活性,延缓IDD,改善腰痛。因此,积极探索更合适的生物载体及药物也为干细胞治疗IDD提供了更多的思路。

3 干细胞治疗IDD的问题和挑战

尽管在干细胞治疗IDD的研究和应用中已经取得了许多进展,但是目前如何使用它们以取得更好的效果仍然需要进一步研究。因此未来还需要进一步研究解决有关干细胞类型、细胞来源、植入方法、细胞数量及体积、安全性以及开发更适合的生物载体等诸多问题。

3.1 干细胞类型

不同类型的干细胞具有不同的分化潜能。现有的证据表明多种类型的干细胞对IDD的治疗都是有效的,但目前尚不清楚哪种组织来源的干细胞是治疗IDD的最佳选择,干细胞的类型选择需要进一步的实验研究与临床验证。胚胎干细胞虽然是一类具有无限增殖能力和多种分化潜能的细胞,但由于其伦理方面等原因,目前研究较少也限制了其临床应用。骨髓MSC来源于骨髓,具有相对容易获取且具有免疫调节功能,然而它们的分化潜能随着扩增次数的增加而降低,从骨髓中收集细胞会导致供体部位疼痛。脂肪来源的MSC具有与骨髓来源的MSC相似的特性,并且具有易获得性和较高的生产效率等优点。Kumar等[34]开展了脂肪干细胞治疗IDD的Ⅰ期临床试验,该临床试验的成功表明了脂肪干细胞治疗IDD的有效性和安全性,滑膜来源的MSC比骨髓和脂肪来源的MSC具有更高的分化潜能。然而,滑膜MSC移植治疗IDD的有效性尚未见报道,有待进一步的实验研究。与其他种类干细胞相比,脐带MSC治疗IDD的研究报道较少,还需要对其安全性和有效性进行验证。庞晓东等[35]通过对11例慢性椎间盘性腰痛患者接受脐带MSC移植治疗,在2年的随访期间,发现疼痛视觉模拟评分(visual analogue scale,VAS)和Oswestry功能障碍指数(Oswestry disability index,ODI)明显下降。因此,移植人脐带来源的MSC是治疗慢性椎间盘性腰痛的良好替代方法。

3.2 干细胞来源

干细胞来源也是临床治疗中必须考虑的问题之一。自体MSC因其具有更高的安全性,在目前的研究中应用广泛,但因其应用成本较高、临床应用需等待周期长,同时具有细胞数量有限的缺点。而异体MSC来源广泛,可提前扩增、提前大量生产与存储,因此具有成本低、临床治疗效率高等优点。椎间盘内无血供,理论上免疫原性的反应很低,因此可广泛应用。但是值得注意的是,虽然这一研究领域已经取得了诸多进展,但是实现更加标准化、安全性更高的应用仍然需要大量问题亟待解决。

3.3 移植方法

移植方法是IDD的细胞治疗的主要障碍之一,干细胞移植绝大多数是采用椎间盘内注射,而注射过程对操作者有一定的技术要求,否则极有可能导致椎间盘进一步损伤,这可能进一步导致IDD。目前关于干细胞静脉注射和椎间盘内注射等方法对损伤椎间盘修复的作用研究比较少,Tam等[36]通过实验研究发现,干细胞静脉注射和椎间盘内注射后都没有改善IDD及恢复椎间盘高度,但两种方式都可能通过旁分泌作用增加了糖胺聚糖蛋白和蛋白聚糖基因的表达。因此,需要大样本的实验,来进一步验证不同移植方法对于IDD的影响,以选择理想的移植方法。

3.4 其他问题

理想的干细胞移植载体应与人体具有生物相容性,具有椎间盘类似的结构和功能。然而,哪种载体最适合干细胞,且不良反应较少,需要进一步研究。

此外,IDD程度与移植干细胞的数量之间的关系目前研究较少;移植的干细胞是否在局部存活也无长期有效的监测手段;干细胞具有较强的分化潜能,干细胞移植后如何保证正常分化而不产生不良的细胞分化甚至是否会诱导肿瘤的发生还需要进一步研究;异体细胞移植是否会发生免疫排斥也无可靠的证据。而且干细胞移植对于操作者也有一定的要求,否则可能导致椎间盘炎和骨髓炎的发生[37]。总之,在干细胞治疗IDD的临床应用中还存在着诸多问题,需要突破这些问题是解决干细胞治疗IDD在临床中应用的关键所在。

4 结 论

随着人们生活方式的改变以及老龄化程度的加重,IDD患者数量逐渐增加,患者的治疗负担也逐渐加重。目前常用的治疗IDD的方法都有着一定的局限性,在经典治疗方法的基础上衍生出一系列的新方法,这些方法补充和完善了IDD治疗的许多方面。值得注意的是,虽然干细胞治疗IDD在临床上已取得初步成功,但仍有许多问题有待解决,需要更多的基础研究和临床试验来寻找干细胞分化的潜在分子机制、理想的细胞来源及类型、优化的移植物和移植方法等。随着研究的不断深入,相信干细胞可以为IDD患者提供更多的选择和帮助。