同种异体骨软骨移植修复关节软骨损伤的生物安全问题

田志,段王平,马永胜,张城铭,卫小春

(山西医科大学第二医院骨科,骨与软组织损伤修复山西省重点实验室,山西 太原 030001)

同种异体骨软骨移植(osteochondral allograft transplantation,OCA)是从组织供者获得整块软骨和软骨下骨来精确修补受损的关节软骨,是一种针对局限性大块关节软骨损伤的有效治疗方式[1]。主要用于青壮年大面积软骨损伤以及微骨折、细胞治疗失败的软骨损伤患者[2]。OCA具有不受供区取材限制、提供与损伤部位相同曲度的关节面、骨融合率高、临床结果可靠等技术优势,在软骨损伤修复领域受到广泛关注[3-5]。但OCA的本质是异体移植,涉及移植物的采集、处理、保存、运输、手术等一系列过程,保证其生物安全极其重要。OCA生物安全检测是保证其生物安全的关键环节,包括供体生物安全检测,软骨组织储存、处理过程中的生物安全检测,受体的生物安全监测,软骨移植过程中生物安全体系建设。本文对OCA修复关节软骨损伤的相关生物安全内容综述如下。

1 供体的生物安全

1.1 一般情况筛查

移植物供体的筛选过程应非常严格,内容包括：年龄、死因(现病史)、既往史(遗传病史、传染病史、慢性自身免疫疾病病史)、外伤及手术史,是否经历过关节手术甚至重症监护病房(intensive care unit,ICU)治疗;还要对供者四肢关节情况进行评估,家族史等进行调查[6];了解供者有无人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)、乙型肝炎病(hepatitis B virus,HBV)、丙型肝炎病(hepatitis C virus,HCV)、结核病或其他传染性疾病的接触史;有无非法药物的滥用史、冶游史甚至同性性行为史;有无动物饲养史、接触史(特别是家禽类,如鸡、鸭、鹅等;家畜类,如猪、羊、牛、狗及啮齿类动物等),为进一步的实验室筛查提供依据[7]。对昏迷及死亡的供者需明确导致其昏迷或死亡的原因,包括：疫苗接种史、血制品应用史、感染性疾病史、职业暴露史等。同时明确供者的五年内旅居史,排除地方性感染暴露的风险。针对地方性感染暴露史,需要采取针对性、目的性强的供者筛查手段或者受者预防措施来预防地方性传染病及人畜共患疾病的传播。

1.2 实验室检查

1.2.1 一般常规检测 对所有供者都应常规检测C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)和血常规。CRP是敏感但特异性不高的炎症指标,CRP≥40 mg/L提示存在感染;≥100 mg/L提示有脓毒症或侵袭性感染可能。血常规主要包括白细胞计数(white blood cell,WBC)和分类计数(包括粒细胞、淋巴细和单核细胞)。对于WBC增多(≥10.0×109/L)或减少(≤3.0×109/L),或者出现“核左移”时,提示可能有感染发生[8]。

1.2.2 病毒学检测 由于病毒培养技术复杂、要求高,常见血源性传播的病毒性疾病主要依靠血清学检测发现。核酸检测(nucleic acid tests,NAT)可用于发现常规血清学筛查漏诊的感染[9-11]。关节软骨供者需进行筛查的血清学检查包括：HIV抗体;HBV的血清学检测,包括HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb;HCV抗体;梅毒螺旋体和非梅毒螺旋体检测(螺旋体血球凝集试验或密螺旋体颗粒凝集试验或荧光密螺旋体抗体吸收试验+快速血浆反应素试验);巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)抗体;EB病毒(epstein-barr virus,EBV)抗体[9-11]。其他针对病毒感染传染性疾病和人畜共患病可以进行筛查的检测包括：HIV、HCV和/或HBV的NAT;人类嗜T淋巴细胞病毒(human T-cell lymphotropic virus,HTLV-1/2)抗体;单纯疱疹病毒IgG抗体;水痘带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)抗体;西尼罗河病毒(west nile virus,WNV)的血清学检测或NAT;球孢子虫血清学、类园线虫血清学和克氏锥虫血清学检测;其他人畜共患疾病,如动物源性逆转录病毒(porcine endogenous retrovirus,PERV)感染检测[9-11]。

1.2.3 细菌学检测 2012年一项大样本量骨移植物易感染性分析结果显示：移植物细菌感染情况与骨软骨组织采集团队的组织获取经验、组织采集时间及移植物来源相关;高毒力致病菌(链球菌、大肠杆菌等)感染与供者死亡时间、ICU治疗史、组织采集部位等相关;低毒力致病菌与组织采集环境、方法、时间、消毒方式相关[12]。除常规实验室检测外,血液学检测还应包括真菌感染以及特殊细菌感染检测等：(1)降钙素原(procalcitonin,PCT)：目前临床常用的判断脓毒血症的生物标记物,当PCT≥2 μg/L时,提示供体可能存在脓毒症,同时PCT数值与感染严重程度正相关;(2)(1,3)-β-D-葡聚糖试验(G试验)：适用于深部真菌感染的早期诊断(不包括隐球菌和接合菌),敏感性较高但易出现假阳性结果(如链球菌血症),只能提示有无真菌侵袭性感染,不能确定感染真菌种类,目前认为其阴性预测值高;(3)半乳甘露聚糖试验(galactomannan,GM试验)：为侵袭性曲霉菌感染的早期诊断提供依据,临床上通常与G试验联合检测,可以提高对侵袭性真菌病的诊断能力;(4)隐球菌荚膜多糖抗原测定：新型隐球菌检测的生物标记物,可早期、快速诊断隐球菌感染;(5)γ-干扰素释放试验(interferon-γ release assay,IGRAs)：对辅助诊断活动性结核病与潜伏性结核感染(latent tuberculosis infection,LTBI)有一定参考价值[8]。除以上血清学检测,还需对供体血液进行细菌培养检测,同时记录取材的关节软骨大体观察结果。

2 软骨组织处理、储存过程中的生物安全

软骨采集、处理应在具有骨软骨采集、保藏资质的保藏机构、实验室或医疗机构中进行,由具有器官、组织采集操作许可的专业人员操作。为了便于病原体检测,采集样本应包括：软骨、骨组织收集、转运、储存过程中常规留取供者的外周血、血清及骨软骨组织进行病原微生物检测或培养;同时可考虑采集供者滑膜组织、关节液、松质骨(部分椎体、髂骨)等标本,积极寻找潜在的病原微生物,为后续监测、治疗提供指导;软骨-骨组织、软骨-骨组织拭子、软骨-骨组织保存液的细菌、真菌以及病毒培养也应列为生物安全评估的常规检查手段[9],但由于低毒力致病菌与组织采集污染相关性较高,其培养结果需结合血液学标志物检测结果共同纳入参考标准[12]。常规细菌微生物检测方法包括：(1)直接涂片染色镜检：革兰染色、抗酸染色、弱抗酸染色、墨汁染色、六胺银染色等能快速检测所提供样本中普通细菌、抗酸杆菌、查奴卡菌、新型隐球菌、肺孢子菌等可能的病原体信息,但确诊仍需要进一步诊断依据;(2)培养：采集供者血液、关节液等无菌体液、骨软骨组织保藏液、灌洗液及拭子等进行细菌和真菌培养;(3)基于核苷酸分子技术原理的病原菌快速检测方法：如环介导恒温扩增技术、微流控碟式芯片反应检测技术、多重巢式聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术、实时荧光定量PCR技术、质谱技术。这些快速检测方法可以明显缩短病原菌的鉴定时间,对常见的临床常见细菌、真菌及罕见菌进行检测,如肠球菌、葡萄球菌属、链球菌属、肠杆菌属、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、白念珠菌等[13]。

3 软骨移植过程中受体的生物安全监测

尽管需进行严格的生物安全筛查,但仍然需要向受者、受者家属强调骨软骨移植过程中有潜在的细菌和病毒传播风险,且病原体来源、发病时间及感染性疾病转归等风险无法量化[14]。受者年龄、全身一般情况、慢性病史(包括糖尿病史、全身或局部感染史甚至口腔感染史)均会对上述风险造成影响。

受体在移植后的1年内的感染风险较大,血清学常规检查和血液培养应纳入常规监测范围,血液培养可以检测到常规检测漏掉的感染情况。考虑到部分合并软骨下骨移植受者可能需要接受免疫抑制治疗,对病原体的免疫反应较弱,样本采集时间和频次为：骨软骨移植前期、移植过程中、移植后1个月、移植后3个月、移植后6个月、移植后1年、移植后2年分别采集1次,之后每间隔2年采集1次[15]。对于一些有糖尿病史、免疫抑制剂使用史的受者,样本采集的频次需要增加。主动筛查及被动筛查过程包括常规实验室检测,以及一系列针对性强的目的性实验室检测。基于骨软骨移植库、骨软骨移植管理平台的建设和完善,对日常收集的临床、实验室检测信息数据进行整合分析,排除可能出现骨软骨移植相关的潜在疾病、新兴疾病,如人源性或动物源性逆转录病毒(porcine endogenous retrovirus,PERV)感染检测。

4 生物安全监测体系建设

骨软骨移植生物安全体系广义上应包括：制定人体骨软骨组织移植法律、法规、管理条例等;完善人体组织尤其是骨软骨组织移植行业标准、从业规范、管理制度;建立常规行业监督制度、从业人员培训考核制度、人体组织捐赠及获取管理制度、骨软骨移植组织库管理制度等。

人体组织移植法律、法规、管理条例方面,目前中国未对人体组织捐献和移植颁布明确的法律、法规。参考2023年《人体器官捐献和移植条例》,骨软骨移植过程中,软骨组织捐献应当遵循自愿、无偿的原则。条例明确规定从事遗体、器官、组织移植的医疗机构需具备所需的设备、设施、技术人员支持;符合人体器官、组织移植伦理审核;完善、健全的器官、组织获取质量管理和控制制度。遗体器官应通过国务院卫生健康部门建立的分配系统统一分配;严格执行器官及组织获取、运输、保藏审核登记制度,移植医师培训考核制度,接受移植患者资格审核、费用监督、生物安全监测制度。从移植职业机构、供者、受者等多方面监管软骨采集、运输、储存、移植过程。

20世纪90年代末,在美国食品药品监督管理局(food and drug administration,FDA)的监督下美国组织库协会(American association of tissue banks,AATB)建立了完整的软骨获取、加工、储存流程,使得OCA移植在临床商业化应用成为可能。随着OCA移植的推广、普及,鉴于软骨组织供体的不可控性,行业标准、从业规范、管理制度、监督制度、从业人员培训考核制度、人体组织捐赠及获取管理制度应参考更为严格的质量控制(quality control,QC)标准甚至异种移植相关的标准操作程序(standard operating procedure,SOP)[15]。综合考虑以下几个方面：

(1)风险评估。需同时考虑到个体健康、公众健康的生物安全,说明可能出现的不确定事件及后果,包括：免疫排斥反应;潜在未知细菌、病毒、真菌等微生物传播可能导致的局部感染、全身感染、甚至移植失败;潜在未知传染性病原体传播可能会导致的人或动物源性传染病,以及新病原体的隐形传播。

(2)传染性病原体细菌、病毒、真菌等筛查。实施病原体筛查的机构需具有成熟的病毒学、细菌学微生物实验室,对特定病原体、传染性病原体和动物源性潜在病原体进行检测;拥有新病原体、难培养病原体甚至病毒分离、培养、鉴定等相关知识、技能和经验的实验人员,能区分人源性或动物源性病原体是来自供体或受体本身,如人源巨细胞病毒和动物源巨细胞病毒的区分[15]。

(3)病原体感染监测。在疑似出现同种或异种感染,以下两种情况应立即通知受者,预警密切接触人员并上报监管机构：①不易被识别的非异种感染病原体;②已被鉴定清楚的潜在异种感染病原体。当受者出现病原体感染症状时,在进行常规诊断检查的基础上,应启动持续筛查程序。骨软骨移植实施医疗机构需说明和执行筛查程序,列明供体来源、使用软骨的部位、数量、移植时间。通过骨软骨移植库、骨软骨移植管理平台的建设和完善,达到满足常规样本采集、潜在感染人员监测等主动、被动筛查程序顺利实施。

(4)病原体感染处理。同时应注意逆转录病毒(包括同种、异种逆转录病毒)的传播风险,如PERV感染问题。需制定相应方案以解决受者PERV以及相似的病毒类病原体检测阳性的情况,包括：鉴别假阳性,当证实病毒来源于被感染的人类细胞后,应继续对病毒进行分离;对造成感染的病毒病原体进行鉴定,当新病原体、难培养病原体、异种病原体等感染发生时,需对所鉴定出的病原体进行特异性说明、制定计划上报上级监管部门、相关的医疗卫生机构和伦理审查委员会,制定临时计划并修改临床研究方案,必要时暂停或终止项目;在骨软骨移植过程中对受者提供应急方案以及后续医疗、护理以及心理咨询;制定骨软骨移植管理办法保护受者、供体采集人员、手术和护理参与人员等密切接触人员以及公共健康安全[15]。

(5)骨软骨移植登记、管理服务平台。包括：受者术前关节液、血样、分离血浆等样本留取、保藏工作;受者常规样本采集以及高危无症状受者针对性样本采集计划;死亡受者尸检档案计划,包括组织病理学检查和病原体培养,受者样本采集部位包括骨软骨移植物本身和移植物相关的、导致受者死亡的主要器官;基于骨软骨移植登记、管理服务平台拟定规范、标准流程,建议样本采集流程达到生物安全等级二级水平,检测流程遵守生物安全等级三级的要求;归档样本均应在-70 ℃以下保存50年以上或直至受者死亡[15]。

针对骨软骨移植操作、保藏及预后的复杂性,应注重骨软骨移植相关的受者及密切接触人群随访问题：受者和与受者有体液接触、以及有皮肤或黏膜接触的护工和实验人员等亲密接触的人群同为风险人群,均可能面临机会性感染甚至人畜共患感染的风险;风险人群与受者接触需采取防护措施,防止传染性病原体的传播;风险人群应延迟涉及体液或其他身体器官的捐献行为;骨软骨移植受者须同意将风险告知风险人群并接受定期进行临床、实验室检查、样本采集以及终身回访;受者应被告知采集和归档的样本将被抽查检测,用于评估疾病、病原体感染状态以及科学研究;受者有责任向监管部门上报其住址和电话的变更情况,以便进行终身回访,受者应同意其医疗信息可被相关公共卫生部门查询,并在法律法规允许的范围内对其信息保密[16]。

同种异体骨软骨的生物安全检测,要求供者年龄一般在15～45岁,排除风湿免疫疾病及肿瘤疾病史,取软骨部位关节软骨完整、无明显退行性变;排除供者细菌感染史、全身感染及局部感染;排除供者病毒感染史,包括DNA病毒、RNA病毒。这些流程尽量在指定的中心或组织库进行,才能保证获取组织的安全性和质量[5]。

异体软骨来源相对丰富,其生物学特征和形态结构与自体软骨相似,是替代自体软骨移植的主要材料。但同种异体软骨移植所带来的生物安全问题是一个需要高度重视的问题,如何规范软骨移植生物安全监测体系,从而降低其潜在的生物安全风险是目前临床、科研、社会工作者亟待解决的重要课题。