青蒿类药物对体外糠秕马拉色菌的抑菌作用

黄美林,周茂林,秦海红,王国江,沈文彤

临床上,真菌感染性疾病较为常见,然而抗真菌药物种类有限,且逐步出现耐药趋势,因此寻找新型抗真菌药物具有重要价值。马拉色菌(Malasseziafurfur)为嗜脂性酵母菌,属于条件致病菌,常寄生于头皮、颈部、腋下、前胸及后背等皮脂腺丰富部位。在天气炎热、皮肤油脂分泌增多或长期使用糖皮质激素及抗菌素等情况下,马拉色菌可在毛囊内及角质层内大量繁殖,并分解皮脂产生甘油三酯及游离脂肪酸,后者刺激皮肤引起炎症反应,如马拉色菌性毛囊炎、花斑糠疹及脂溢性皮炎等。程露等［1］研究发现,在马拉色菌性毛囊炎、花斑糠疹及脂溢性皮炎患者皮损中培养分离的马拉色菌对两性霉素B等抗真菌药物有耐药现象。骆万婷等［2］指出青蒿类药物除治疗疟疾外,还可抑制念珠菌、新型隐球菌、曲霉、卡氏肺孢子菌、尖孢镰刀菌、皮肤癣菌、酿酒酵母的生长。而青蒿类药物对马拉色菌是否有抑菌作用,文献罕有报道。本研究旨在探索青蒿提取物、青蒿琥酯及蒿甲醚对糠秕马拉色菌抑菌活性及最小抑菌浓度(minimum inhibitory concen-tration, MIC),为研发青蒿类药物治疗马拉色菌感染性疾病提供实验依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验药物 青蒿提取物(陕西艾特生物科技有限公司,批号:20230421);青蒿琥酯(北京盈芯生物科技有限公司,批号:P23JZ112F);蒿甲醚(华武制药,批号:20230315);酮康唑(上海麦克林生化科技股份有限公司,批号:C14716537)。

1.1.2实验菌株 糠秕马拉色菌标准株(菌种编号:BNCC337308)购于北京北纳创联生物技术研究院(中国普通微生物菌种保存分中心)。

1.1.3实验试剂 麦芽浸粉购于北京奥博星生物技术有限公司;牛胆汁粉、甘油单油酸酯、吐温40、琼脂、麦芽糖、酵母浸膏、葡萄糖均购于上海麦克林生化科技股份有限公司;二甲基亚砜购于安徽省明光市明科实验器材经营部。

1.1.4实验仪器 UTP-313电子天平(上海花潮电器有限公司);DNP-9082电热恒温培养箱(上海精宏实验设备有限公司);BSC-1100ⅡB2-X生物安全柜(济南鑫贝西生物技术有限公司);XFS-280CB手提式压力蒸汽灭菌器(浙江新丰医疗器械有限公司);ZC-MCF麦氏比浊仪(北京哲成科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1培养基制备 取麦芽浸粉40 g,牛胆汁粉20 g,甘油单油酸酯2.5 g,吐温40 10 g,琼脂15 g,蒸馏水1.0 L,放入烧杯中待其充分溶解后121 ℃灭菌15 min制成马拉色菌固体培养基;取麦芽糖 20 g,酵母浸膏2 g,葡萄糖20 g,橄榄油20 g,蒸馏水1.0 L,按上述方式制成马拉色菌液体培养基。

1.2.2菌悬液制备 取装有糠秕马拉色菌标准珠菌粉的安瓿瓶,根据说明书吸取0.5 mL无菌生理盐水溶解菌粉,均匀涂布于固体培养基上,置于30 ℃培养箱,培养72 h。再取该固体培养基的菌落接种于新固体培养基,再培养72 h。后取新培养菌落配制成菌悬液,用麦氏比浊仪调整菌液浓度刻度为0.5,再用液体培养基将其稀释10倍,此时孢子的菌落形成单位(colony forming units, CFU)含量为1.0～2.0×106CFU/mL。

1.2.3药液制备 根据文献,分别取青蒿提取物800 mg、青蒿琥酯100 mg、蒿甲醚100 mg、酮康唑2.5 mg溶于100%二甲基亚砜溶液1 mL,配置成800 mg/mL青蒿提取物溶液、100 mg/mL青蒿琥酯溶液、100 mg/mL蒿甲醚溶液、10 mg/mL酮康唑溶液。将配置好的青蒿提取物、青蒿琥酯、蒿甲醚、酮康唑药液分别用液体培养基稀释为80 mg/mL、10 mg/mL、10 mg/mL、1 mg/mL,作为初始浓度药液备用。此时二甲基亚砜的浓度<1%,对照实验证实该浓度二甲基亚砜不抑制马拉色菌生长。

1.2.4琼脂平板扩散法(打孔法)测定抑菌作用 在马拉色菌固体培养基平板表面接种0.1 mL糠秕马拉色菌悬液并涂布均匀,用直径6 mm无菌打孔器在培养基平板上均匀打5个孔;将上述配置的青蒿提取物、青蒿琥酯、蒿甲醚、酮康唑药液在试管中分别倍比稀释4次(在该方法中为保证最后1孔为无抑菌作用孔,酮康唑药液的初始浓度调整为0.25 mg/mL),依次将初始浓度及试管中的青蒿提取物、青蒿琥酯、蒿甲醚、酮康唑药液加入孔内,每孔药液加满为止。将培养基平板放入30 ℃恒温培养箱中培养48 h。以不含药液、接种菌悬液的固体培养基作为阳性对照,以不接种菌悬液的固体培养基作为阴性对照。

1.2.6微量液基法测定抑菌作用 取96孔微量板在每排第1孔内分别加入200 μL初始浓度青蒿提取物、青蒿琥酯、蒿甲醚、酮康唑药液,后按照倍比稀释的方法依次稀释药液至第10孔;于每排第2～11孔内加入液体培养基100 μL,第12孔内加入200 μL 液体培养基。每排第1～11孔内加入制备好的菌悬液100 μL。以不含药液,含液体培养基及菌悬液的第11孔作为阳性对照,以仅含液体培养基的第12孔作为阴性对照。上述实验板放入30 ℃恒温箱培养48 h。

1.2.7微量液基法测定结果判读 48 h后观察各孔中菌落生长情况,以阳性对照孔生长良好为准,用肉眼及放大镜观察各孔中菌落生长情况,即各组药液的药敏情况,孔中液体表面清澈无菌落生长用“-”表示,有菌落生长用“+”表示。取无肉眼可见菌落生长的最低药物浓度孔位作为该试验的MIC。

1.2.8协同实验 将青蒿提取物、青蒿琥酯、蒿甲醚分别与酮康唑以各自的MIC等比混合,作为协同实验的初始浓度,并根据上述微量液基法测定其协同抑菌作用。

2 结果

2.1琼脂平板扩散法测定结果 采用琼脂平板扩散法(打孔法)分别测定不同浓度的青蒿提取物、青蒿琥酯、蒿甲醚、酮康唑对糠秕马拉色菌的抑菌作用(图1)。先后测量上述药物的抑菌直径,重复3次实验。结果显示,当青蒿提取物抑菌浓度为≥10.00 mg/mL、青蒿琥酯抑菌浓度为≥1.25 mg/mL、蒿甲醚抑菌浓度为≥1.25 mg/mL、酮康唑抑菌浓度为≥0.03 mg/mL,产生了抑菌效果,且其抑菌效果与药物浓度呈正相关,见表1。

表1 青蒿类药物及酮康唑对糠秕马拉色菌的抑菌直径

Artemether experimental dish;Positive control;Negative control

2.2微量液基稀释法测定结果 结果显示,青蒿提取物的MIC为10.00 mg/mL,青蒿琥酯的MIC为0.63 mg/mL,蒿甲醚的MIC为0.63 mg/mL,酮康唑的MIC为0.03 mg/mL,见表2。

表2 青蒿类药物及酮康唑对糠秕马拉色菌的最小抑菌浓度

2.3协同实验测定结果 青蒿提取物与酮康唑协同组、青蒿琥酯与酮康唑协同组及蒿甲醚与酮康唑协同组的MIC均为0.03 mg/mL,与酮康唑单独试验结果相同,表明青蒿类药物与酮康唑无协同抗菌作用。

3 讨论

既往多项研究探索了青蒿类药物对真菌的抑制作用。Marinas等［3］研究显示,青蒿油对酵母菌株的抑菌范围为0.51～16.33 mg/mL;陈德宇等［4］研究显示,青蒿油对石膏样小孢子菌的MIC为2.5 mg/mL、对白色念珠菌的MIC为20 mg/mL、对红色毛癣菌及絮状表皮癣菌的MIC均为6.25 mg/mL;刘碧凤等［5］研究显示,青蒿酯钠对铁锈色小孢子菌的MIC为0.625 mg/mL;金慧玲等［6］研究显示,青蒿琥酯对石膏样小孢子菌、玫瑰毛癣菌及白色念珠菌的MIC均为9 mg/mL,青蒿琥酯对红色毛癣菌及表皮癣菌的MIC均为12 mg/mL。近年,Khatoon等［7］研究发现,青蒿素合成的纳米银离子复合物对3种念珠菌均有抑菌作用,其MIC为80～120 μg/mL。Shah等［8］研究发现,青蒿素纳米悬浮液在水中的溶解度及抗白念珠菌的功效显著提高。以上研究均证实,青蒿类药物对多种致病真菌有抑菌活性,尤其纳米青蒿药物抑菌强度明显高于普通青蒿类药物。

然而,既往关于青蒿类药物马拉色菌抑菌作用的研究较少。在中草药抗马拉色菌研究方面,刘迪等［9］研究显示,丁香酚对马拉色菌的MIC为0.313 mg/mL;李军等［10］研究显示,苦豆草提取物对马拉色菌的MIC为50 mg/mL;付蓉等［11］研究发现,土槿皮、侧柏叶、苦参、丁香、肉桂水煎合剂对糠秕马拉色菌的MIC为5.5 mg/mL;王洁等［12］研究显示,香鳞毛蕨对糠秕马拉色菌的MIC为1.56～3.13 mg/mL。本研究结果显示,青蒿琥酯及蒿甲醚对糠秕马拉色菌的抑菌强度高于既往文献中的苦豆草、土槿皮及香鳞毛蕨,但低于丁香酚;而青蒿提取物抑菌强度高于苦豆草提取物,低于土槿皮及香鳞毛蕨。总之,虽然青蒿类药物抑菌强度不如酮康唑,但与大部分中草药相比青蒿类药物抑菌强度较强,表明青蒿类药物可有效抑制糠秕马拉色菌。另外,协同实验结果显示,酮康唑与青蒿提取物、青蒿琥酯、蒿甲醚均未显示出协同作用,原因可能与酮康唑抑菌浓度远远低于上述药物浓度有关。

虽然马拉色菌毛囊炎、花斑癣及脂溢性皮炎等疾病的主要病因为马拉色菌感染,但在其病理生理过程中还可呈现明显的炎症反应。而青蒿类药物,除能够对糠秕马拉色菌产生抑菌作用外,还具有较强的抗炎活性。刘颖等［13］研究显示,青蒿琥酯可以抑制皮脂腺细胞促炎症因子的表达;廖梦玲等［14］研究表明,青蒿琥酯可以抑制巨噬细胞前炎症因子释放。在临床研究方面,Wang等［15］证实蒿甲醚乳剂治疗玫瑰痤疮的疗效与甲硝唑乳膏相当;Shen等［16］研究证实,蒿甲醚乳剂治疗痤疮的疗效与夫西地酸膏相当,且蒿甲醚乳剂治疗的复发率较低。

综上所述,青蒿类药物既能够对马拉色菌产生抑菌作用,又能够拮抗炎症反应,为其治疗马拉色菌感染性皮肤病提供药物优势,也为研发青蒿类药物的洗浴用品或药品提供了实验依据。