草鱼源鲁氏耶尔森菌的分离鉴定及药敏试验

宋一晓，孙坤，刘学美，李子雁，隋智海*

（1.临沂大学生命科学学院，山东 临沂 276000；2.山东临沂市河东区农村农业局，山东 临沂 276034）

草鱼（Ctenopharyngodon idellus），为典型的草食性淡水鱼类，隶属于鲤形目（Cypriniformes），雅罗鱼亚科（Leuciscinae），草鱼属（Ctenopharyngodon）[1]，与青鱼、鳙、鲢并称为“四大家鱼”，为中国养殖产量较高的淡水经济鱼类之一，2021 年养殖产量为557 万t[2-3]。因其肉质鲜美、营养丰富、价格低廉等，广受消费者喜爱。但随着养殖规模的扩大和养殖密度的增加，草鱼病害如草鱼呼肠孤病毒（Grass carp reovirus, GCRV）、柱状黄杆菌（Flavobacterium columnare）、维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）等频发，造成了较大的经济损失，严重制约了草鱼养殖产业健康发展[4-6]。

2022 年5 月，山东省临沂市蒙阴县某草鱼养殖场暴发病害，病鱼出现游动缓慢、觅食困难、口腔和体表出血、皮肤溃烂、脾脏肿大呈暗红色和肝脏肿大充血等症状。为查明病因，从患病草鱼脾肝肾混合组织中，分离纯化出一株细菌，基于形态观察、生理生化试验、16S rRNA 序列和系统发育分析等，进行了种类鉴定，并测定了其药物敏感性。拟为草鱼病害的有效防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 时间与地点

2022 年5 月。试验地位于临沂大学膜蛋白与药物工程实验室。

1.2 材料

1.2.1 试验鱼从临沂蒙阴县某草鱼养殖场收集濒临死亡的草鱼，体长约25 cm，体质量约1.5 kg。

1.2.2 试剂和仪器

LB 培养基（酵母提取物5 g/L，氯化钠10 g/L，蛋白胨10 g/L）、琼脂粉、琼脂糖、2×Taq PCR Master Mix[生工生物工程（上海）股份有限公司]、细菌基因组DNA 提取试剂盒（DP302）（天根生化科技（北京）有限公司）；革兰染色液试剂盒（HB8278）、生理生化鉴定管（青岛海博生物有限公司）；药敏纸片（杭州微生物试剂有限公司）；生物安全柜BSC-1304IIA（苏州安泰空气技术有限公司）、低速研磨器（天根生物有限公司）、台式离心机Pico-21（Thermo Fisher）、电泳仪（北京市六一仪器厂）、凝胶成像系统FR-1000（上海复日科技有限公司）、PCR 仪ETC 811（北京东胜创新生物科技有限公司）、恒温摇床QYC-200（上海福玛实验设备有限公司）、培养箱DMJM-358（宁波江南仪器厂）。

1.3 试验方法

1.3.1 病原菌分离与纯化

用75%乙醇喷洒患病草鱼体表并擦拭。用灭菌手术剪剖开鱼腹部，采集病鱼肝脏、脾、肾等组织，加入无菌PBS，采用低速组织研磨器，碾碎混匀。用接菌环，蘸取组织悬液，于LB 琼脂培养基上划线，置于28 ℃培养，选择具有生长及生物学优势的菌株，在LB 琼脂培养基上纯化2 次。将处在生长对数期的菌株溶液，与同体积50%甘油混匀，于-80 ℃冰箱中保存，备用。

1.3.2 病原菌形态学观察

将细菌LB 液体培养至对数期，用接种环于LB固体平板上划线，28 ℃过夜培养，观测单菌落形态、大小和颜色等特征。取10 μL 对数期菌悬液，涂布在载玻片上，按照革兰染色液试剂盒说明书，经结晶紫初染、碘液媒染、95%乙醇脱色、沙黄复染和自然干燥后，用光学显微镜观察其结构特征。

1.3.3 病原菌生理生化试验

将细菌LB 液体培养至对数期，向生理生化鉴定管加50 μL 菌悬液，用无菌封口膜封住管口，置于37 或42 ℃培养，完成MR-VP、赖氨酸脱羧酶肉汤、ONPG、尿酸酶、明胶、鸟氨酸脱羧酶肉汤、氨基酸脱羧酶对照、42 ℃生长试验、不同浓度的胰胨水、糖类、醇类、精氨酸双水解酶肉汤、氧化酶试纸等生理生化鉴定。试验重复3 次。

1.3.4 16S rRNA 的PCR 扩增与系统发育分析

取4 μL 菌液接种至新鲜的4 mL LB 液体中，过夜培养，将菌液12 000 g 离心5 min，收集1.5 mL菌体，用细菌基因组DNA 提取试剂盒，提取其基因组，作为PCR 扩增的模板。采用16S rRNA 基因通用引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1492R：5’-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’扩增目的片段，预期大小为1 500 bp。PCR 反应体系（50 μL）：2×Taq PCR Master Mix 25 μL、基因组DNA1 μL、27F 2.5 μL、1492R 2.5 μL、无菌水19 μL。

PCR 反应程序：（1）95 ℃预变性10 min；（2）94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共30 次循环；（3）72 ℃保温10 min。PCR 反应产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。采用在线BLASTN 程序（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast），进行序列同源性比对，下载同源性的16S rRNA 基因序列，采用MEGA-X软件邻接法（Neighborjoining method, NJ），构建系统发育树。

1.3.5 药敏试验

采用纸片扩散法进行药敏特性测定。选用分别含一定浓度的羧苄西林、氨苄西林、米诺环素、头孢唑啉、新霉素、红霉素、头孢拉定、丁胺卡那、四环素、环丙沙星、头孢哌酮、复方新诺明、头孢曲松、克林霉素、诺氟沙星、呋喃唑酮、多黏菌素B、哌拉西林、麦迪霉素、氯霉素等20 种抗生素药敏纸片。在无菌条件下，将60 μL 培养至对数期的新鲜菌液，均匀涂布在LB 琼脂平板上，待琼脂培养基表面基本干燥后，将药敏纸片分别贴于琼脂培养基上，倒置培养24 h，观察抑菌圈并测量直径大小，按照试剂盒说明书，判定其对药物的敏感性。试验重复3 次。

2 结果与分析

2.1 病原菌形态特征

从病鱼肝脾肾混合组织中分离得到一株优势菌株，该菌株在LB 平板上形成表面光滑、边缘整齐、不透明的圆形菌落[图1（a）]。经革兰染色后，呈现红色、短杆状，表明该菌株为革兰阴性菌[图1（b）]。

图1 病原菌形态特征

2.2 16S rRNA 基因序列扩增及进化树分析

以该菌株基因组DNA 为模板，PCR 扩增16S rRNA 基因序列，扩增条带单一，无非特异性扩增，位于1 000～2 000 bp 之间，符合预期大小，见图2。经BLASTN 序列比对后，发现其与鲁氏耶尔森菌MYR-184（Yersinia ruckeriMYR-184）（GenBank No.MK290740.1）相似度高达100%。基于16S rRNA 基因序列构建系统发育树，结果显示，该菌株与鲁氏耶尔森菌亲缘关系最近，聚在同一分支，表明该菌株可能为鲁氏耶尔森菌，见图3。

图2 菌株16S rRNA 的PCR 扩增

图3 基于16S rRNA 基因序列构建系统发育树

2.3 生理生化特性

通过生理生化鉴定管试验，测定菌株生理生化特征。结果表明，该菌株在1%～3%氯化钠（NaCl）、42 ℃条件下均可生长，在鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、MR-VP、β-半乳糖苷酶、甘露糖、甘露醇试验中，结果为阳性；在尿素酶、精氨酸双水解酶、6%～10%NaCl、乳糖、纤维二糖、阿拉伯糖、蔗糖、氧化酶、明胶的试验中，结果为阴性，见表1。该试验结果与鲁氏耶尔森菌标准菌株的生理生化特征相似。

表1 菌株生理生化特征①

2.4 菌株药敏特性

通过纸片扩散法，检测分离菌株对药物的敏感性。结果表明，该菌株对环丙沙星、头孢曲松、诺氟沙星等11 种药物呈高度敏感；对四环素、米诺环素、呋喃唑酮药物呈中度敏感；对万古霉素、麦迪霉素、头孢唑啉等6 种药物呈耐药性，见表2。

表2 菌株药物敏感性测定①

3 讨论

病原细菌感染的草鱼，经常引起肠炎、烂鳃、肝胆综合征、出血症等，导致其大量死亡[7]。其中，鲁氏耶尔森菌（Yersinia ruckeri）是一种短杆状的革兰阴性病原菌，隶属于肠杆菌科、耶尔森菌属，易感染鲑、鳟类和温水性鱼类，可引起典型的红口病，并伴有不同程度的内脏发炎充血症状[8-10]。鲁氏耶尔森菌具有较强的环境适应力和广泛的宿主范围，目前已从不同国家养殖的鱼类如虹鳟、鲢、鳙、斑点叉尾等分离和鉴定出[11-15]。此外，耶尔森氏菌还可与其他病原菌如嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）、柱状黄杆菌（F.columnare）和杀鲑气单胞菌（A.salmonicida）等混合感染鱼类，引发病害[16-17]。本试验从患病草鱼内脏组织内分离纯化出一株菌株，经过形态学、生理生化、16S rRNA 序列分析等确定其为鲁氏耶尔森菌，通过表型鉴定和分子遗传学鉴定相结合，使鉴定结果更加准确可靠。

药敏试验结果表明，该菌株已具备多重耐药性，但也存在对一定数量的抗生素敏感。这与其他的研究结果既有相似之处，也有不同之处。例如：与Y. ruckeriXB2 对麦迪霉素耐受结果一致[18]，与Y.ruckeriFF003 对新霉素中度耐受结果不一致[16]。

根据水产养殖用药明白纸2022 年2 号规定，今后可考虑适当使用硫酸新霉素粉（水产用）、维生素C 磷酸醋镁盐酸环丙沙星预混剂、盐酸环丙沙星盐酸小檗碱预混剂来防治鲁氏耶尔森菌，避免滥用药物导致耐药菌加速进化。