虎杖苷对AML细胞增殖、迁移、侵袭及肿瘤生长的影响 Δ

华 敏，张伟丽 （滕州市中心人民医院输血科，山东 滕州 277599）

急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）是一种异质性血液系统恶性肿瘤，以骨髓、血液和其他组织中髓系原始细胞克隆性扩增为主要特征[1―2]。尽管化疗手段有所进展，但AML 患者预后仍然较差[3]。因此，有必要进一步了解AML 的相关机制并寻找新型治疗药物。

虎杖苷（polydatin，PD）是一种从虎杖根中分离出来的活性成分，具有抑制血小板聚集、降低血脂水平、减少脂质过氧化等多种活性。研究发现，PD 可以通过诱导细胞凋亡来抑制AML 的发展，但具体机制尚未明确[4]。上皮-间充质转化（epithelial mesenchymal transition，EMT）是指上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型特征细胞的生物学过程，是肿瘤得以进展的重要分子机制之一[5]。EMT过程涉及多种标志蛋白，包括锌指转录因子Snail、上皮钙黏素（E-cadherin）和波形蛋白（vimentin）等[6]。环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）/蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）是AML研究领域的常见通路，激活该信号通路可抑制AML 细胞的增殖，对AML 的治疗具有积极效果[7―8]；此外，cAMP/PKA 信号通路还可参与调控EMT 进程[9]。结合现有文献，本研究拟基于EMT和cAMP/PKA信号通路，初步探讨PD对AML细胞增殖、迁移、侵袭的影响，并通过构建裸鼠移植瘤模型，从体内水平初步验证PD的抗AML活性，以期为AML的治疗药物开发提供参考。

1 材料

1.1 主要仪器

本研究所用主要仪器包括iMark680 型多功能酶标仪、Gel Doc EZ 型凝胶成像仪（美国Bio-Rad 公司），FACS Calibur 流式细胞仪（美国BD Biosciences 公司），Eclipse Ti-S型倒置显微镜（日本Nikon公司）等。

1.2 主要药品与试剂

PD 对照品（批号20210407，纯度≥98%）购自滁州仕诺达生物科技有限公司；cAMP 抑制剂SQ22536 对照品（批号HY-100396，纯度98.41%）购自美国MedChem-Express 公司；Annexin Ⅴ-FITC/PI 双染细胞凋亡检测试剂盒购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；MTT细胞增殖及毒性检测试剂盒购自江西艾博因生物科技有限公司；兔源vimentin、Snail、E-cadherin、PKA、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）单克隆抗体和辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG 二抗（货号分别为ab92547、ab229701、ab40772、ab75991、ab9485、ab6721）均购自英国Abcam 公司；cAMP 酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司；RPMI 1640 培养基、ECL显色试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司。

1.3 细胞与实验动物

人AML细胞KG-1（批号CL-0132）购自武汉普诺赛生命科技有限公司；人原代正常骨髓单核细胞（bone marrow mononuclear cells，BMMC；批号905810）购自北京诺为生物技术有限公司。

SPF 级雄性BALB/c 裸鼠（4～6 周龄，体重18～20 g）24 只，购自山东博安生物技术股份有限公司，动物生产许可证号为SCXK（鲁）2020 0006。所有动物均饲养于每12 h 光照/黑暗交替、温度18～23 ℃、相对湿度55%～65%的环境中，自由摄食、饮水。本研究方案经滕州市中心人民医院动物伦理委员会审核批准（编号2020-10-171）。

2 方法

2.1 细胞实验

2.1.1 细胞培养

将BMMC 和KG-1 细胞分别接种于含10%胎牛血清的RPMI 1640 培养基中，于37 ℃、5%CO2条件下培养。

2.1.2 PD干预浓度筛选

采用MTT 法检测。收集BMMC 和KG-1 细胞，按1×104个/mL、每孔100 μL 接种在96 孔板上，培养24 h待细胞进入对数生长期时，以不同浓度[0（对照）、10、30、60、90、120 μmol/L]的PD[4]继续培养24 h，每浓度设置6个复孔，并设置只含培养基的空白孔。随后，在每孔中加入5 mg/mL的MTT试剂25 μL，室温孵育4 h后，加入二甲基亚砜（DMSO）100 μL，充分振荡后，使用酶标仪于570 nm 波长处检测各孔的光密度（OD）值，计算细胞活力[细胞活力（%）＝（OD实验组－OD空白孔）/（OD对照组－OD空白孔）×100%]，并根据检测结果筛选后续实验的PD干预浓度。

2.1.3 细胞分组与处理

取对数生长期的KG-1细胞，分为正常组，低、中、高浓度PD组（L-PD、M-PD、H-PD组），SQ22536组，高浓度PD 和SQ22536 联用组（H-PD+SQ22536 组），每组设置6个复孔。正常组细胞正常培养24 h，L-PD、M-PD、H-PD组细胞分别以10、30、60 μmol/L的PD（浓度参考相关文献[4]和“2.1.2”项下结果设置）培养24 h，SQ22536 组细胞以100 μmol/L 的cAMP 抑制剂SQ22536（浓度参考相关文献[10]设置）培养24 h，H-PD+SQ22536 组细胞同时以60 μmol/L的PD和100 μmol/L的SQ22536培养24 h。

2.1.4 PD对KG-1细胞活力的影响考察

采用MTT法检测。取对数生长期的KG-1细胞，按“2.1.3”项下方法分组、处理，随后按“2.1.2”项下方法检测各组细胞的OD值，用以表示其活力。

2.1.5 PD对KG-1细胞凋亡的影响考察

采用流式细胞术检测。取对数生长期的KG-1 细胞，按“2.1.3”项下方法分组、处理。收集各组细胞，于室温下以1 000×g离心5 min，用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤3 次，再用Annexin Ⅴ结合缓冲液500 μL 重悬；于避光环境下，加入Annexin Ⅴ-FITC、PI 试剂各5 μL，染色15 min，使用流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率。

2.1.6 PD对KG-1细胞侵袭、迁移能力的影响考察

采用Transwell 实验检测。用上室涂有基质胶的Transwell 小室评估KG-1 细胞的侵袭能力，用上室未涂基质胶的Transwell 小室评估KG-1 细胞的迁移能力，具体操作如下：取对数生长期的KG-1细胞，用不含血清的RPMI 1640 培养基重悬至4×105个/mL；取上述细胞悬液100 μL 置于Transwell 上室，同时将含10%胎牛血清的RPMI 1640 培养基600 μL 置于Transwell 下室，于37 ℃下孵育24 h。将上层细胞按“2.1.3”项下方法分组、处理后，收集穿膜细胞，以4%多聚甲醛固定后，再用0.05%结晶紫染液染色2 h。使用显微镜观察各组细胞的侵袭、迁移情况并记录侵袭、迁移细胞数。

2.1.7 PD对KG-1细胞上清液中cAMP水平的影响考察

采用ELISA 法检测。取对数生长期的KG-1 细胞，按“2.1.3”项下方法分组、处理。收集各组细胞，用PBS洗涤3 次，以1 500×g离心10 min，取上清液，使用酶标仪于450 nm 波长处检测cAMP 水平。具体操作严格参照相应试剂盒说明书执行。

2.1.8 PD对KG-1细胞EMT相关蛋白和PKA蛋白表达的影响考察

采用Western blot 法检测。取对数生长期的KG-1细胞，按“2.1.3”项下方法分组、处理。收集各组细胞，用PBS 洗涤2 次，以裂解液裂解，再于4 ℃下以12 000×g离心10 min，收集上清液，测定蛋白含量后作加热变性处理。取变性蛋白，进行10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并转移至聚偏二氟乙烯膜上，于室温下以5%脱脂奶粉封闭1 h；洗膜后，加入E-cadherin、vimentin、Snail、PKA、GAPDH 一抗（稀释比例分别为1∶2 000、1∶2 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶2 000），于4 ℃下孵育过夜；洗膜后，加入相应二抗（稀释比例为1∶4 000），于室温下孵育2 h，使用ECL显色试剂盒显影，于凝胶成像仪下成像。使用Image J 1.8.0软件分析各蛋白的灰度值，并计算目的蛋白的相对表达量[目的蛋白的相对表达量＝目的蛋白的条带灰度值/内参蛋白（GAPDH）的条带灰度值]。

2.2 动物实验

取对数生长期的KG-1细胞，以PBS配制细胞悬液。取上述悬液，按1×107个/只接种于裸鼠右侧腋窝皮下。接种后15 d，将24 只裸鼠分为对照组、PD 组、SQ22536组、PD+SQ22536 组，每组6 只。PD 组裸鼠腹腔注射5 mg/kg 的PD（以0.1%DMSO 为溶剂，剂量参考相关文献[11]设置），SQ22536 组裸鼠腹腔注射3.2 mg/kg 的SQ22536（以0.1%DMSO 为溶剂，剂量参考相关文献[12]设置），PD+SQ22536 组裸鼠腹腔注射5 mg/kg 的PD 和3.2 mg/kg 的SQ22536，对照组裸鼠腹腔注射0.1%DMSO，每天1 次，连续4 周。末次给药次日，所有裸鼠经麻醉后处死，取出其瘤体并称重，同时计算瘤体体积（瘤体体积＝肿瘤长度×肿瘤宽度×肿瘤宽度/2）。

2.3 统计学方法

3 结果

3.1 细胞实验结果

3.1.1 PD干预浓度筛选结果

10、30、60、90、120 μmol/L 的PD 对BMMC 活力均无显著影响（P＞0.05），表明其对该细胞无明显毒性。与对照组比较，10、30、60、90、120 μmol/L 的PD 均可显著降低KG-1 细胞活力（P＜0.05），且其对KG-1 细胞的半数抑制浓度（IC50）接近60 μmol/L，因此选择10、30、60 μmol/L 作为后续实验PD 的干预浓度。结果见图1。

a：与对照组比较，P＜0.05。图1 PD干预浓度筛选的折线图（±s，n＝6）

3.1.2 PD对KG-1细胞活力和凋亡的影响

与正常组比较，PD各浓度组细胞的OD值均显著降低，凋亡率均显著升高，均呈浓度依赖性（P＜0.05）；而SQ22536 组细胞的OD 值显著升高，凋亡率显著降低（P＜0.05）。与H-PD 组比较，H-PD+SQ22536 组细胞的OD值显著升高，凋亡率显著降低（P＜0.05）。结果见表1、图2。

表1 各组KG-1细胞OD值和凋亡率比较（±s，n＝6）

表1 各组KG-1细胞OD值和凋亡率比较（±s，n＝6）

a：与正常组比较，P＜0.05；b：与L-PD组比较，P＜0.05；c：与M-PD组比较，P＜0.05；d：与H-PD组比较，P＜0.05。

组别正常组L-PD组M-PD组OD值0.88±0.09 0.72±0.08a 0.51±0.06ab凋亡率/%14.76±1.62 18.51±1.91a 23.95±2.52ab组别H-PD组SQ22536组H-PD+SQ22536组OD值0.34±0.03abc 0.99±0.15a 0.83±0.07d凋亡率/%29.48±3.16abc 10.04±1.27a 17.68±1.79d

图2 各组KG-1细胞凋亡情况的流式图

3.1.3 PD对KG-1细胞迁移、侵袭的影响

与正常组比较，PD各浓度组的迁移、侵袭细胞数均显著降低，均呈浓度依赖性（P＜0.05）；而SQ22536 组的迁移、侵袭细胞数均显著升高（P＜0.05）。与H-PD组比较，H-PD+SQ22536 组的迁移、侵袭细胞数均显著升高（P＜0.05）。结果见图3、表2。

表2 各组KG-1细胞迁移和侵袭情况比较（±s，n＝6）

表2 各组KG-1细胞迁移和侵袭情况比较（±s，n＝6）

a：与正常组比较，P＜0.05；b：与L-PD组比较，P＜0.05；c：与M-PD组比较，P＜0.05；d：与H-PD组比较，P＜0.05。

组别正常组L-PD组M-PD组迁移细胞/个280±30 142±16a 113±12ab侵袭细胞/个154±28 117±14a 71±8ab组别H-PD组SQ22536组H-PD+SQ22536组迁移细胞/个71±7abc 337±37a 161±18d侵袭细胞/个37±4abc 205±28a 109±15d

图3 各组KG-1 细胞迁移、侵袭情况的显微图（结晶紫染色）

3.1.4 PD 对KG-1 细胞上清液中cAMP 水平和细胞中PKA蛋白表达的影响

与正常组比较，PD各浓度组细胞上清液中cAMP水平和细胞中PKA蛋白相对表达量均显著升高，均呈浓度依赖性（P＜0.05）；而SQ22536 组cAMP 水平和PKA 蛋白相对表达量均显著降低（P＜0.05）。与H-PD组比较，H-PD+SQ22536 组上述指标均显著降低（P＜0.05）。结果见表3、图4。

表3 各组KG-1 细胞上清液中cAMP 水平和细胞中PKA蛋白相对表达量比较（±s，n＝6）

表3 各组KG-1 细胞上清液中cAMP 水平和细胞中PKA蛋白相对表达量比较（±s，n＝6）

a：与正常组比较，P＜0.05；b：与L-PD组比较，P＜0.05；c：与M-PD组比较，P＜0.05；d：与H-PD组比较，P＜0.05。

组别正常组L-PD组M-PD组cAMP/（pmol/mL）0.70±0.06 0.93±0.09a 1.22±0.13ab PKA/GAPDH 0.43±0.05 0.64±0.07a 0.85±0.07ab组别H-PD组SQ22536组H-PD+SQ22536组cAMP/（pmol/mL）1.51±0.17abc 0.37±0.02a 0.85±0.09d PKA/GAPDH 1.23±0.15abc 0.21±0.02a 0.52±0.06d

图4 各组KG-1细胞中PKA蛋白表达的电泳图

3.1.5 PD对KG-1细胞中EMT相关蛋白表达的影响

与正常组比较，PD各浓度组细胞中E-cadherin蛋白的相对表达量均显著升高，vimentin、Snail蛋白的相对表达量均显著降低，均呈浓度依赖性（P＜0.05）；而SQ22536组细胞中E-cadherin蛋白的相对表达量显著降低，vimentin、Snail 蛋白的相对表达量均显著升高（P＜0.05）。与H-PD 组比较，H-PD+SQ22536 组细胞中Ecadherin 蛋白的相对表达量显著降低，vimentin、Snail 蛋白的相对表达量均显著升高（P＜0.05）。结果见表4、图5。

表4 各组KG-1细胞中EMT相关蛋白相对表达量比较（±s，n＝6）

表4 各组KG-1细胞中EMT相关蛋白相对表达量比较（±s，n＝6）

a：与正常组比较，P＜0.05；b：与L-PD组比较，P＜0.05；c：与M-PD组比较，P＜0.05；d：与H-PD组比较，P＜0.05。

组别正常组L-PD组M-PD组H-PD组SQ22536组H-PD+SQ22536组E-cadherin/GAPDH 0.34±0.04 0.63±0.07a 0.91±0.11ab 1.25±0.14abc 0.13±0.02a 0.48±0.05d vimentin/GAPDH 0.95±0.15 0.73±0.09a 0.54±0.06ab 0.25±0.03abc 1.27±0.13a 0.88±0.09d Snail/GAPDH 0.95±0.13 0.76±0.09a 0.53±0.07ab 0.32±0.02abc 1.32±0.15a 0.87±0.09d

图5 各组KG-1中细胞EMT相关蛋白表达的电泳图

3.2 动物实验结果

与对照组比较，PD 组裸鼠的瘤体体积及质量均显著降低（P＜0.05），而SQ22536 组裸鼠的瘤体体积及质量均显著升高（P＜0.05）；与PD组比较，PD+SQ22536组裸鼠的瘤体体积及质量均显著升高（P＜0.05）。结果见图6、表5。

表5 各组裸鼠瘤体体积及质量比较（±s，n＝6）

表5 各组裸鼠瘤体体积及质量比较（±s，n＝6）

a：与对照组比较，P＜0.05；b：与PD组比较，P＜0.05。

组别对照组PD组瘤体体积/mm3 333.35±36.57 130.69±15.27a瘤体质量/g 0.54±0.07 0.26±0.03a组别SQ22536组PD+SQ22536组瘤体体积/mm3 426.80±45.35a 306.59±25.57b瘤体质量/g 0.82±0.09a 0.45±0.04b

图6 各组裸鼠瘤体图示

4 讨论

PD 为白藜芦醇衍生物，是一种天然的二苯乙烯类多酚化合物，具有抗癌、保护心脏、抗糖尿病、保胃、保肝、保护神经、抗微生物等作用[13]。Wang等[4]发现，PD可通过将细胞阻滞于S期来诱导其凋亡，进而发挥对AML的治疗作用；王春美等[14]也发现，PD 可有效抑制人单核细胞白血病细胞THP-1的增殖，并可通过阻滞细胞周期来诱导细胞凋亡，从而对AML 起到改善作用。本研究用PD处理BMMC，结果显示，10、30、60、90、120 μmol/L的PD 对BMMC 活力无明显影响，表明PD 对正常细胞无明显毒性；而上述浓度的PD可使KG-1细胞活力显著下降，凋亡率显著升高，与既往研究结果[4，14]基本一致。此外，体内实验结果显示，PD可显著降低裸鼠瘤体体积及质量，以上结果提示PD 可能成为AML 的潜在治疗药物。

恶性肿瘤细胞具有高度迁移性和侵袭性，抑制肿瘤细胞迁移和侵袭可抑制肿瘤进展[15]。Zhang 等[16]发现，抑制AML 细胞迁移和侵袭，可以阻止AML 的恶化。EMT 是上皮细胞转换为间质细胞并获得迁移和侵袭能力的过程，涉及E-cadherin、vimentin、Snail 等标志蛋白。其中，E-cadherin 是上皮细胞黏附分子，在EMT 过程中表达明显下调；vimentin 是一种中间丝蛋白，在EMT 过程中表达明显上调；Snail 可与Smad 相关蛋白1 竞争性结合E-cadherin 编码基因启动子近端的E-box 序列，从而抑制E-cadherin表达、上调vimentin表达，可诱导EMT的发生；E-cadherin 表达的下调和vimentin、Snail 表达的上调均与细胞迁移、侵袭能力的增强有关[5―6]。本研究发现，经PD 处理后，迁移、侵袭细胞数均显著减少，vimentin、Snail蛋白的表达均显著下调，E-cadherin蛋白的表达显著上调，表明PD 可能通过升高KG-1 细胞Ecadherin 蛋白的表达来阻止其获得间质表型，使细胞维持上皮表型特征，进而抑制KG-1细胞的迁移和侵袭。

cAMP/PKA 信号通路是细胞内经典途径之一，cAMP 是首个被发现的第二信使，在细胞信号转导中具有关键作用，并可通过下游PKA来调节各种靶基因的转录，参与肿瘤细胞生长、迁移、侵袭等多种生理病理过程[17]。研究指出，激活cAMP/PKA 信号通路可抑制AML细胞的增殖，并诱导其凋亡[8，18]。本研究结果显示，经PD 处理后，KG-1 细胞上清液中cAMP 水平和细胞中PKA 蛋白的表达均显著升高，推测PD 可能通过激活cAMP/PKA信号通路来发挥抑制AML发展的作用。为了进一步证实此推测，本研究分别以cAMP 抑制剂SQ22536 和PD+SQ22536 处理KG-1 细胞，结果发现，SQ22536 的作用效果与PD 相反，并可逆转PD 对KG-1细胞的抑制活性。这提示PD 对KG-1 细胞恶性生物学行为的抑制作用可能是通过激活cAMP/PKA 信号通路实现的。

综上所述，PD 可能通过激活cAMP/PKA 信号通路来抑制KG-1细胞的增殖、迁移、侵袭，诱导细胞凋亡，抑制EMT进程及肿瘤生长，从而发挥抗AML作用。