单细胞测序技术解析IgA肾病免疫细胞改变的研究进展

甘言刚,杨琼琼

(中山大学孙逸仙纪念医院肾内科,中山大学孙逸仙纪念医院医学研究中心,广东 广州 510120)

IgA肾病(IgA nephrology,IgAN)是全球范围内最常见的原发性肾小球肾炎之一,主要表现为半乳糖缺陷型 IgA1(galactose-deficient IgA1,Gd-IgA1)在肾脏系膜区沉积[1]。几乎所有患者在预期寿命内都可能出现终末期肾衰竭[2]。IgAN的发病机制尚不明确[3]。IgAN患者存在免疫系统紊乱[4],GWAS等遗传学研究表明,IgAN患者存在抗原呈递(如MHC)、补体系统(如CFH、CFHR3-1、ITGAM-ITGAX)和黏膜免疫(如DEFA、CARD9、VAV3)相关的单核苷酸多态性改变[5～8]。多种免疫细胞在IgAN发生发展中起重要作用。APRIL和BAFF可促进B细胞IgA类别转换及糖基化异常导致IgAN[9,10]。B细胞中的TLR9可以识别PAMPs和/或DAMP,并通过APRIL和IL-6通路诱导Gd-IgA1的产生[11]。T细胞亚群的失衡亦可导致B细胞的增殖及Gd-IgA1分泌异常[4]。此外,在IgAN患者肾脏组织标本中发现免疫细胞浸润,巨噬细胞及肾脏纤维化相关[12]。因此,探究免疫细胞在IgAN中的作用及机制具有重要科学研究价值。

传统意义上的普通转录组测序(bulk RNA-seq)已经提供了大量的关于IgAN基因表达改变的信息。外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)转录组学研究发现肉眼血尿发作期间的差异基因主要富集在IFN-γ信号传导和抗原呈递相关通路[13],CX3CR1基因及其配体fractalkine和IgAN患者肉眼血尿密切相关[14]。利用显微切割技术将IgAN患者肾小球进行bulk RNA-seq,发现内皮增生与先天免疫应答、经典补体通路激活和基质转换通路相关[15]。但是,bulk RNA-seq会掩盖特异的细胞群体或状态的基因表达情况,比如在Gd-IgA1产生以及在IgA1复合物沉积中起主要作用的细胞类型。单细胞RNA测序(single-cell RNA sequencing,scRNA-seq)是在单个细胞水平对mRNA进行高通量测序的一项新技术,针对单个细胞研究其整体水平的基因表达情况,常用于识别新的细胞类型、确认罕见的细胞群、构建细胞状态和系统发育的图谱[16]。能够克服传统bulk RNA-seq限制,进行更加精细的细胞、分子水平的剖析。由于测序技术和细胞分离技术的快速发展,测序细胞数量由最初的几百个细胞发展到成千上万个细胞,并且测序性价比越来越高。分析方法也在持续改进,包括细胞类型的确定、高维数据的降维、无监督聚类、系统发生建模、轨迹推断、多数据集的协同分析等。

在IgAN研究领域,通过将具有不同分子分型的免疫细胞进行聚类,以鉴定出可能与Gd-IgA1产生及沉积相关的免疫细胞亚群及表达差异。单细胞测序技术的发展还使肾脏中的细胞与细胞通讯研究、单细胞水平的调节状态研究成为可能。总之,单细胞测序技术的迅猛发展使人们能够进一步了解免疫相关性肾病中细胞的异质性,并具有阐明致病性抗体产生及其在肾脏中沉积的复杂机制的巨大潜力,为确立免疫性肾病精准治疗策略提供新的思路。本文综述了在IgAN患者中进行的scRNA-seq研究的结果,随着单细胞研究的深入,相信未来将有更多单细胞相关研究应用于IgAN发病及机制的探索。

1 scRNA-seq识别IgAN 患者外周血免疫细胞亚群及信号通路

IgAN患者肾脏系膜区存在以IgA1为主的聚合物沉积,主要为Gd-IgA1。研究显示IgAN患者血清Gd-IgA1水平与患者eGFR下降相关[17]。Gd-IgA1主要由抗体分泌的B细胞或浆细胞产生,因此阐明Gd-IgA1产生细胞的起源以及转录组谱的改变具有重要的科学研究价值。我们课题组前期利用单细胞转录组测序技术发现IgAN患者B细胞降维聚类分为4个亚群,IgAN患者外周血B2亚群细胞数显著增加,B2细胞数量与IgAN患者血清C4水平呈正相关。IgAN患者B细胞差异基因发现B细胞活化标记物CD69在IgAN B细胞中表达上调,差异基因富集于病毒感染相关的途径中,包括疱疹病毒、人嗜T细胞病毒、EB病毒和巨细胞病毒,提示 B细胞在IgAN中的改变可能与病毒感染导致的B细胞激活有关[18]。此外,有研究利用scRNA-seq鉴定了细胞因子刺激IgAN患者来源的IgA1分泌细胞的特有亚群,该亚群具有 C1GALT1低表达的特征[19]。这些结果表明,细胞因子介导的特定亚群及信号转导的改变对GdIgA1产生起重要作用。

辅助性T细胞极化失衡在炎症性疾病和自身免疫性疾病中起着重要作用[20,21]。幼稚CD4+T细胞在抗原-主要组织相容性复合体分子刺激下进行克隆扩增,分化为特异性效应辅助性T细胞,包括辅助性T细胞(helper T cell,Th) 1、Th2、Th17、滤泡辅助T细胞(follicular helper T cell,Tfh)和调节性T细胞[22]。Tfh细胞可通过IL-21和CD40L信号促进B细胞增殖和分化[23]。研究者在IgAN患者PBMC中发现Tfh、Th2及Th17比例增加,进一步利用scRNA-seq鉴定IgAN患者PBMC中CD4+T细胞亚群及信号通路改变[24]。该研究发现在IgAN患者中Tfh细胞差异基因在调节B细胞分化、CD40-CD40L信号通路、细胞粘附和细胞因子分泌相关通路富集。Tfh功能基因(包括ICOS、STAT3、IL21R、IL6R、LTA和TNFSF14)表达上调,进一步提示Tfh细胞存在活化表型,Tfh细胞可能通过激活了B细胞促进IgAN肾病发生发展[24]。基于这些研究提示IgAN患者在特定抗原如病毒感染后可与T细胞相互作用共同促进B细胞激活分化,促进Gd-IgA1产生增多及疾病进展。Nefecon可靶向抑制Peyer’淋巴结的B细胞局部激活,减少IgAN患者蛋白尿及肾小球滤过率下降[25]。通过抑制B细胞BAFF和APRIL通路的激活(如泰它西普、阿塞西普)也可显著降低IgAN患者血清IgA1水平及蛋白尿[26,27]。因此,scRNA-seq对于鉴定IgAN患者外周血免疫细胞亚群及通路具有重要价值,对于IgAN患者靶向B细胞治疗有重要启示作用。

2 scRNA-seq探究IgAN肾组织亚群及信号通路

在IgAN中各种因素可导致Gd-IgA1的合成增加,且易于形成多聚IgA1并与自身抗体形成免疫复合物。IgA1免疫复合物的沉积触发系膜增殖和各种细胞因子、趋化因子和细胞外基质成分的分泌[28]。这些致病因素促进系膜细胞其他肾细胞之间相互作用,最终导致肾小球硬化、肾小管萎缩和间质纤维化[29]。一项纳入13例IgAN患者、6例对照的研究对肾组织及外周血CD14+细胞进行了scRNA-seq,首次描绘了IgAN的肾脏组织单细胞水平图谱,并初步探讨了IgAN系膜增殖、免疫炎症相关的可能发病机制[30]。研究中通过降维聚类共分为10个细胞群,主要有肾小管细胞、足细胞、内皮细胞、系膜细胞、肾小管闰细胞,还有部分免疫细胞如T细胞、巨噬细胞[30]。通过转录差异分析发现IgAN系膜细胞差异基因主要富集在细胞粘附、细胞外基质相关通路,且发现J CHAIN在系膜细胞高表达[30]。J CHAIN主要功能是机体在形成IgM或IgA多聚体时起到一个铰链作用,以及辅助抗体的转运、识别等[31]。该研究中首次发现J CHAIN在IgAN系膜细胞中的高表达,说明其可能是IgA抗体免疫复合物倾向于沉积在IgAN患者的肾小球系膜区的原因。通过对IgAN和对照组的外周血CD14+细胞进行单细胞测序分析发现,IgAN肾脏原位巨噬细胞表现出NOTCH信号通路、糖酵解、脂肪酸代谢等生物学过程的异常,还发现IgAN肾脏CD8+T细胞的免疫耗竭相关的基因表达增强,细胞毒性相关基因表达减弱,可能提示IgAN患者肾脏中的T细胞功能异常[30]。其他scRNA-seq发现IgAN患者系膜细胞表达JAGGED1,内皮细胞表达其受体NOTCH4,表明Jagged/Notch信号通路参与了IgAN的发病机制;PDGFRB在系膜细胞及成纤维细胞均表达,其可能是系膜增殖和肾纤维化的潜在治疗靶点[32]。

3 scRNA-seq揭示IgAN早期改变

IgAN早期病变发生的机制尚不明确,scRNA-seq技术可以发现早期转录组改变及细胞间相互作用。ddY小鼠是一种自发性IgA肾病动物模型,在系膜区可见 IgA以及 IgG、IgM 和 C3 的共沉积[33]。研究者利用ddY IgAN小鼠模型,基于scRNA-seq技术探讨IgA肾病早期阶段发生的分子变化。发现内皮细胞是单细胞水平基因表达差异最显著的细胞类型,其在疾病早期免疫细胞招募和浸润中发挥重要作用。内皮细胞中表达水平显著上调的基因与内皮细胞功能紊乱、促炎以及介导T细胞激活迁移等过程密切相关,提示内皮细胞对免疫细胞及白细胞的激活和招募发挥重要的作用[34]。该研究揭示了内皮细胞在IgAN早期阶段特别是免疫细胞招募和浸润中的重要作用。抑制内皮细胞相关差异基因及信号通路可能是IgAN早期阶段干预的重要手段。

4 IgAN细胞间相互作用分析

细胞之间具有十分复杂的相互作用,这些相互作用在疾病发生及发展中起着至关重要的作用。细胞-细胞之间的相互作用可以从scRNA-seq数据中计算受体-配体表达值相关性进行研究。在IgAN患者中免疫细胞之间及免疫细胞与肾脏细胞中存在广泛的相互作用。NK细胞和经典单核细胞是IgAN中主要相互作用的细胞,NK细胞的传出和传入相互作用强度均降低,而单核细胞的相互作用强度均升高;在对照组中发现6个信号通路(TNF、IL16、CXCL、MPZ、FASLG和NCAM)是特有的,而有2个信号通路(MIF、LIGHT)在IgAN中特有[18]。IgAN患者Tfh细胞与B细胞相互作用增强,IgAN患者的多种受体-配体特别是LTA/TNFSF14(LIGHT)-TNFRSF14的相互作用增强[24]。在肾脏中,系膜细胞和内皮细胞通讯作用最强,说明在IgAN患者系膜细胞增殖过程中,内皮细胞与系膜细胞之间可能存在紧密的相互作用,共同导致了系膜区的病理变化[30]。此外,系膜细胞与巨噬细胞、T细胞亦存在较强的相互作用,既往研究亦发现巨噬细胞浸润与IgAN患者不良预后相关[35]。此外,在IgAN肾组织中系膜细胞与足细胞亦存在显著的相互作用,这可能也是IgAN患者出现蛋白尿的原因[32]。综上,IgAN存在细胞间通讯改变,因此改变IgAN患者异常细胞间通讯可能是抑制B细胞激活及减少蛋白尿的潜在治疗策略。

5 思考与挑战

近年来,单细胞水平的分析使得我们开始理解细胞群体的复杂性和异质性,克服了传统bulk RNA-seq测序分析不足以完全表征生物学复杂性的缺点。ScRNA-seq促进了IgAN的机制研究,促进了IgAN患者诊断和治疗的发展。然而,在单细胞研究广泛开展的大背景下,我们也不得不去思考单细胞技术应用于IgAN研究的局限性。首先,在单细胞的分离和捕获过程中,单细胞的活性和完整性可能受到影响,从而导致下游分析中显示的细胞功能可能已经不同于其在体内环境下的功能状态;第二,真核细胞转录并不以稳定的基础速率进行,而是以脉冲形式出现。因此,在一个特定的时间点检测到细胞中特定基因的转录本是一个不明确的结果,对结果的解释应侧重于通路分析和基因集合富集分析,而不是单个基因的表达或功能作用。第三,除了scRNA-seq的这些固有局限性之外,scRNA-seq依赖于存活的单细胞悬液,这种悬液很容易从外周血或淋巴结中获得,但通常很难从实体组织中获得。样本保存条件的差异也可以引起转录组的大量变化。第四,在不同的时间处理样品,即使有轻微的技术变化,也会产生严重的批处理效应。

综上,IgAN是最常见的肾小球疾病,其异质性强,治疗存在挑战,发病机制尚未阐明。scRNA-seq从单细胞层面解析了IgAN患者PBMC及肾组织细胞亚群及通路改变。IgAN患者外周血B细胞差异基因与B细胞激活、病毒感染相关通路相关,且与Tfh细胞相互作用增强。IgAN肾组织中的系膜细胞、内皮细胞及其与免疫细胞之间存在广泛细胞间相互作用。未来随着蛋白组学、表观组学及空间转录组技术发展,将成为揭示IgAN发病机制的更为有力技术和方法。