Myo、Gas6、SOX9 mRNA在AMI患者中的表达意义及在PCI术后联合检测对预后的评估价值

郭会敏, 安静霞, 李辉

邯郸市中心医院心血管内科(河北邯郸 056000)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)发病急且病死率高,逐渐成为危害人类生命健康的危重症冠心病之一[1]。临床早期常用重建治疗开通患者的梗死部位,保证患者近远期预后。目前,急诊经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention,PCI)已成为AMI的首选治疗方案,但高血栓负荷状态下,极易导致AMI患者PCI后出现慢血流、无复流等不良情况,所以需要给予患者相应药物干预,避免血栓发生[2-3]。虽然PCI目前广泛用于AMI患者的治疗,但患者在治疗后极易发生不良心血管事件(majoradverse cardiac events,MACE),增加了治疗后的死亡风险[4]。肌红蛋白(myoglobin,Myo)主要存在于心肌细胞中,是一种小分子蛋白质,当心肌细胞受损时,相较于常见心脏标志物,如肌钙蛋白,Myo可更快地释放到血液中,表达快速升高[5]。生长停滞特异性蛋白6(growth arrest specific protein 6,Gas6)是维生素K依赖性蛋白家族成员,其与氨酸激酶成员结合,可共同发挥各种生物学作用[6]。SRY相关高迁移率族蛋白(SRY-related HMG Box,SOX),是机体中一种转录调节因子,其结构域高度保守,当其与指定DNA序列结合时,可适当将靶基因激活,以产生各种生物学功能,其中具有代表性的SOX9 mRNA蛋白还参与心肌细胞增殖,当其表达降低时,可能会在一定程度上导致心肌细胞逐渐下降,对心肌细胞正常运行有不良影响[7]。但就目前而言,关于Myo、Gas6、SOX9 mRNA在AMI患者中变化研究较少,基于此,本研究将AMI作为研究对象,分析患者Myo、Gas6、SOX9 mRNA的表达意义及在PCI术后联合检测对预后评估价值,旨为AMI患者的临床评估和诊治提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取本院2020年1月至2021年6月收治的166例AMI患者作为研究组,其中包括男105例,女61例;年龄51～79岁,平均(62.96±7.64)岁;根据 是否发生心力衰竭,包括57例无心力衰竭患者,54例轻中度心力衰竭患者,55例重度心力衰竭患者;合并症如下:73例合并高血压,55例糖尿病,27例合并高血脂;体质指数(body mass index,BMI)19～26 kg/m2,平均(23.63±3.19)kg/m2;同时选取在该时间段内,在本院接受体检且健康人员,将其纳入对照组,共计90例,其中包括男67例,女23例;年龄51～78岁,平均(63.19±6.75)岁;BMI 19～27 kg/m2,平均(23.89±3.27)kg/m2。两组性别、年龄构成比较,差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经本院医学伦理委员会审核并批准(伦理批号:TJIRB20190502)。

纳入标准:(1)符合《急性心肌梗死诊断和治疗指南》[8]诊断标准;(2)患者均行PCI术;(3)发病后24 h内完成PCI手术;(4)近1个月内无AMI病史;(5)患者及家属均签署知情同意书。

排除标准:(1)住院期间,实行急诊PCI;(2)活动时,可能发生出血风险;(3)合并肝肾功能不全、恶性肿瘤等疾病;(4)脑血管病急性期;(5)处于妊娠期或哺乳期;(6)存在自身免疫功能疾病。

1.2 方法

1.2.1 Myo、Gas6水平检测 分别采集对照组和研究组的清晨空腹外周静脉血5 mL,并送至检验,对其行3 000 r/min转速离心处理,离心半径为10 cm;15 min后,将其分离并取得上清液置于-80℃冰箱内,等待备检。其中Myo和Gas6水平的检测均采用酶联免疫吸附操作,首先将完成凋亡的细胞行裂解操作,随后对其行高速离心操作,完成后可发现其上清液有核小体,将吸附后的蛋白体加入上清液内,使其两者之间DNA抗体与DNA发生结合;加酶的底物,测光吸收制,试剂盒购自北京中杉金桥生物,详细步骤按照说明书进行操作。

1.2.2 SOX9 mRNA水平检测 使用肝素抗凝管收集所有纳入研究人员外周静脉血5 mL,将其单个细胞进行分离并应用RNA提取并悬浮,完成后将其置于-80℃冰箱,待测SOX9 mRNA含量。采用SOX9 mRNA分离试剂盒(上海瑞番生物科技)提取所需总RNA,详细步骤按照说明书进行,再使用逆转录试剂盒将cDNA合成,合成PCR引物,将反应体系为每个样品设3个重复,循环条件为95 ℃。反应条件为95 ℃和60 ℃下分别循环30 s、95 ℃下预变性3 min,并将60 ℃的温度下时间延长至30 s退火,并将72 ℃延伸至60 s,共计39个循环。引物序列为上游5′-TCGTGGGTCGTGTCTGGTGTTGC-3′,下游5′-GCAGAGTCCGAGGTATTC-3′;以GAPDH作为SOX9 mRNA归一化内参基因,内参上游5′-CAGTGCAGGGTCCGAGG-3′,下游5′-TCGCAGGGTCCGAGGTATTC-3′。

1.2.3 预后分组 根据患者住院期间是否发生MACCE将研究组患者分为MACCE组和非MACCE组,MACCE是指全因死亡、脑血管事件、任何MI和任何血运重建的复合事件,主要包括严重心律失常、心室颤动、心源性死亡等。

1.3 观察指标 (1)对比研究组和对照组Myo、Gas6、SOX9 mRNA表达情况;(2)Myo、Gas6、SOX9 mRNA在AMI患者PCI术前后中表达情况;(3)分析MACCE组和非MACCE组Myo、Gas6、SOX9 mRNA表达情况;(4)观察患者预后随访6个月内发生MACCE的情况,根据预后是否发生MACCE分组,分为MACCE组和非MACCE组,单因素分析两组资料临床差异;(5)分析Myo、Gas6、SOX9 mRNA联合对AMI预后评估价值。

2 结果

2.1 对照组和研究组Myo、Gas6、SOX9 mRNA表达差异 研究组Myo和Gas6明显高于对照组,SOX9 mRNA表达明显低于对照组(P<0.05),见表1。

表1 对照组和研究组Myo、Gas6、SOX9 mRNA表达差异对比

2.2 对比Myo、Gas6、SOX9 mRNA在AMI患者PCI术前后中表达情况 术后研究组患者Myo、Gas6表达相较术前均明显降低,SOX9 mRNA明显升高(P<0.05),见表2。

表2 Myo、Gas6、SOX9 mRNA在AMI患者PCI术前后对比

2.3 分析MACCE组和非MACCE组Myo、Gas6、SOX9 mRNA表达情况 对患者行6个月的随访,发现其中30例患者发生MACCE,占比18.07%,未发生MACCE患者有136例,占比81.93%;MACCE组Myo和Gas6明显高于非MACCE组,SOX9 mRNA表达明显低于非MACCE组(P<0.05),见表3。

表3 MACCE组和非MACCE组Myo、Gas6、SOX9 mRNA表达差异对比

2.4 单因素分析MACCE组和非MACCE组临床因素差异 MACCE组和非MACCE患者年龄、脑钠肽(BNP)、高敏C反应蛋白(hs-CRP)和术后出血存在显著差异,主要表现为MACCE组年龄、BNP、hs-CRP表达和术后出血占比明显高于非MACCE组(P<0.05);两组其他指标对比差异无统计学意义(P>0.05),见表4。

表4 单因素分析MACCE组和非MACCE组临床因素差异

2.5 多因素分析影响AMI患者PCI术预后危险因素 多因素分析赋值年龄、BNP、hs-CRP、术后出血、Myo、Gas6、SOX9 mRNA将MACCE作为研究因变量,将年龄、用药情况及术后出血作为自变量,结合临床实际情况,对本研究logistic回归模型中指标进行择优筛选,年龄大、术后出血、Myo和Gas6表达高、SOX9 mRNA表达低是影响经PCI治疗AMI患者发生MACCE独立危险因素(P<0.05),见表5。

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表5 Logistic回归分析影响AMI患者PCI术预后的独立危险因素

2.6 分析Myo、Gas6、SOX9 mRNA联合对AMI预后评估价值 Myo、Gas6、SOX9 mRNA联合评估AMI预后ROC曲线下面积为0.936,具有较高的特异度以及敏感度,且显著高于单独Myo、Gas6、SOX9 mRNA检测ROC曲线下面积0.706、0.696和0.711,3种检测方式分析预测模型有统计学差异(Z=2.261,P<0.05),见表6、图1。

图1 Myo、Gas6、SOX9 mRNA联合对AMI预后评估价值ROC曲线

表6 Myo、Gas6、SOX9 mRNA联合对AMI预后评估价值

3 讨论

AMI是指冠状动脉疾病导致冠状动脉灌注不足,导致心脏不能及时接受血液供应或出现血流减少/终末期,最终导致严重且持续的心肌缺血和坏死,对细胞膜通透性造成损害,导致细胞内代谢产物得到更多释放,使其达到外周循环血内[9]。而PCI临床常规使用并不能完全清除体内血栓,但介入手术会引起局部微血栓形成,对接受手术患者而言,可能对其机体组织产生伤害,尤其对机体的缺血性损伤,伤害较大,导致血管内血流减慢,对患者的预后有严重的不良影响,因此临床需对AMI患者PCI术后MACCE的发生做到早期预测,同时寻找可准确评估患者预后的生物标志物极为重要[10-11]。

Myo在机体内主要在骨骼肌和心肌中有明显的存在,在人体内被称为氧结合血红素蛋白,临床主要将其用于心肌损伤的诊断中,因从该指标的敏感度和特异度来看,其主要表现为敏感性相对较高,但特异性较低,所以其也是冠脉再通后再梗阻敏感且快速的标志物,因Myo分子量较小,所以当机体心肌细胞受损时,其将被大量释放,且释放速度极为迅速,据相关数据显示,Myo在心肌细胞受损释放过程中,6～8 h内即可达到浓度最高值[12]。本研究发现,相较于对照组,研究组Myo表达明显较高,MACCE组Myo高于非MACCE组(P<0.05);与谢振林等[13]学者的研究一致,该学者研究发现,Myo通常在肾脏清除后30 h内消失,如果患者接受成功血运重建治疗,在治疗后约24 h内恢复正常。该情况特征可用于临床确定患者是否有复发性血管闭塞,而随着梗塞面积的增加,肌肉血清开始从受伤的心肌细胞释放到血液中,导致其浓度增加。分析原因主要是由于Myo是一种亚铁血红蛋白,其主要在心肌和骨骼肌内存在,在其他组织和平滑肌内均不表现,在机体内主要作用是将氧气给予储存或转移,所以当机体发生剧烈运动时间或心肌损伤后,其可能自心肌细胞扩散,逐渐进入血液并参加体内循环,进而出现水平急剧上升的情况[14]。

Gas6的分布范围主要是机体内皮、平滑肌细胞,主要作用是当机体转导通路运行时,其均可参加,所以当机体无论是组织细胞增殖,还是发生炎症反应,Gas6均可发挥显著调控作用,尤其当组织细胞出现周期停滞生长过程中,其表达明显升高,较常规状态下,此时Gas6表达约增加30倍左右[15]。刘畅等[16]学者的动物实验中,发现缺血性心脏病大鼠发生心肌细胞凋亡时,Gas6可以通过自我分泌途径参与该过程,其表达将明显升高本研究发现,相较于对照组,研究组Gas6表达明显较高,MACCE组Myo高于非MACCE组(P<0.05),与朱水龙等[17]研究一致,该学者研究发现AMI患者血清Gas6水平异常升高,分析原因主要是由于Gas6参与了左心室重构的发生和发展,当动脉粥样发生时,Gas6通过血管平滑肌细胞表达生长促进因子,进一步增加细胞繁殖,促进动脉粥样硬化的发生发展,当血管损伤后,血管结缔组织中血管平滑肌细胞的增殖和聚集是血管重构的主要原因,进而 导致AMI发生[18]。

SOX9 mRNA被发现时,是在短肢发育不良疾病中,且研究数据显示,当妊娠期间胚胎SOX9 mRNA表达降低时,其在妊娠期间出现死亡的概率明显升高,可能是由于SOX9 mRNA参与和调节心肌发育,是心脏发育必需的同源基因,而当SOX9 mRNA表达降低时,心肌细胞内膜垫细胞的生长、繁殖将受到一定的阻碍,增加细胞凋亡率,进而导致该类胚胎在生长发育过程中,可能出现心内膜垫的不良生长和发育,进而诱发充血性心力衰竭,影响心肌细胞的吧表达。影响心肌正常生长[19-20]。本研究发现,相较于对照组,研究组SOX9 mRNA表达明显较低,MACCE组SOX9 mRNA低于非MACCE组(P<0.05),分析其原因主要是,当缺血性心肌损伤发生后,心脏纤维化会明显严重,而在该过程中,SOX9 mRNA是主要调节因子,在心肌损伤过程中占据重要作用,此外,其还参与调节心肌细胞肥大,进而引发心肌疾病发生[21]。与Tang等[22]学者的研究一致,该学者认为SOX9表达的增加可能与AMI的发生及斑块的稳定性密切相关:首先AMI患者体内会产生大量转化生长因子-β,从而影响旁分泌或自分泌途径,增加SOX9的过表达;其次过表达SOX9与心肌素的血管平滑肌细胞,较单独过表达心肌素的血管平滑肌细胞正常收缩表型被明显地抑制,这种抑制作用被证明可能AMI患者的SOX9与心肌素相互作用,导致心肌素介导启动子活性给予降低,最终导致AMI的发生。此外,本研究logistic回归模型结果显示年龄、术后出血、Myo、Gas6、SOX9 mRNA是影响经PCI治疗AMI患者发生MACCE的独立危险因素(P<0.05),分析原因首先是年龄>65岁患者由于自身免疫力低下,自身基础疾病较多,运动较少、血液循环较差,而术后出血可增加血栓形成风险,临床应加以防控[23]。对AMI患者PCI术后评估,发现Myo、Gas6、SOX9 mRNA联合评估AMI预后ROC曲线线下面积为0.936,具有较高的特异度以及敏感度,提示临床对AMI患者行PCI术后,加强指标的联合检测,为预后MACCE的发生预防提供借鉴。虽然本研究取得一定研究成果,但仍存在一定的局限性,因本研究纳入的患者例数过少可能导致结果出现一定的偏倚性,因此在今后的研究中,应进一步扩大样本量,分析Myo、Gas6、SOX在AMI患者中的表达意义及在PCI术后联合检测对预后评估价值。

利益相关声明:本文作者均声明不存在任何利益冲突。

作者贡献说明:郭会敏设计研究方案,实施研究过程,论文撰写;安静霞提出研究思路,分析试验数据,论文审核;郭会敏、李辉参与实施研究过程,资料搜集整理,论文修改;安静霞、李辉进行统计学分析。