不同贮藏温度下稻花鸡肉优势腐败菌变化及Arrhenius货架期预测模型的建立

刘梦竹，徐志宏,，魏琦麟，涂杜，康桦华*

（1.岭南现代农业科学与技术广东省实验室肇庆分中心,广东肇庆 526238）

（2.广东省农业科学院动物卫生研究所,农业农村部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站,广东省畜禽疫病防治研究重点实验室,广东广州 510640）

稻花鸡又名雪花鸡，属灵山彩凤鸡种，是灵山香鸡与野山鸡经过30 多年杂交选育而成的独特品种[1]，其肌肉组织发达，煮熟后皮脆，脂肪少，口感细腻，鸡味浓郁，是广东地区制作白切鸡等菜肴的重要原料[2]。鸡肉的营养丰富，适合微生物生长繁殖，因此鸡肉在贮藏过程中易发生腐败变质，货架期缩短，影响消费者的安全健康[3-5]。鸡肉的贮藏时间、温度、包装气体组成是其腐败变质的重要因素[6-8]，导致食品腐败变质的微生物即腐败菌是影响肉制品腐败变质的重要因素[9,10]。在活鸡下架生鲜鸡上市的政策下，有关稻花鸡肉在不同贮藏温度下货架期的研究未见报道，因此研究鸡肉在加工、运输、贮藏和销售等环节中优势腐败菌和菌落总数的变化，建立准确可靠的货架期预测模型，监控鸡肉贮藏过程中品质及微生物变化能够降低鸡肉腐败变质的风险[11-13]，对稻花鸡行业的发展具有极显著的现实意义和实用价值。

本文前期高通量测序研究稻花鸡肉在不同贮藏温度下细菌组成多样性的结果表明，不同贮藏温度后期鸡肉的优势腐败菌均为假单胞菌属（Pseudomonas）和沙雷氏菌属（Serratia）[14]，本研究在此基础上，纯化与鉴定优势腐败菌，根据鉴定结果探究25 ℃常温保存、4 ℃冷藏保鲜和0 ℃冰温贮藏过程中优势腐败菌及菌落总数的变化情况；以菌落总数和两种优势腐败菌为关键品质因子建立Arrhenius 方程，构建稻花鸡肉货架期预测动力学模型。通过构建的菌落总数货架期预测模型、假单胞菌货架期预测模型、沙雷氏菌货架期预测模型，监控稻花鸡肉的品质变化，为稻花鸡肉的安全贮藏提供一定理论依据。

1 材料与方法

1.1 原料

生鲜稻花鸡（每只约1.95 kg），恩平兴宇生态农业有限公司；生鲜托盘，桐城市阳光塑业有限公司；25 m×20 cm 聚乙烯保鲜膜，佳能食品级保鲜膜；分析纯甘油，国药集团化学试剂有限公司；假单胞菌CFC 选择性培养基及添加剂（PseudomonasCFC Selective Agar），青岛日水生物技术有限公司；紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基（Violet Red Bile Glucose Agar）培养基、营养琼脂（Nutrient Agar）、缓冲蛋白胨水（Buffered Peptone Water），广东环凯微生物科技有限公司。

1.2 主要仪器设备

FJ300-SH 均质机，上海标本模型厂；GQZ60-02XG 控温型保鲜箱，天津捷胜东辉保鲜科技有限公司定制；HWS 智能型恒温箱，宁波江南仪器厂制造；5Q6892 威玛德温湿度检测仪，广州威德玛环境仪器有限公司；BCD-648WDBE 海尔冰箱，海尔集团；YC-395L 2～8 ℃医用冰箱，中科美菱生物医疗有限公司；SW-CJ-2D 超净工作台，苏州净化设备有限公司；LRH 生化培养箱，上海一恒科学仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品处理

购买于恩平兴宇生态农业有限公司的稻花鸡为当天凌晨屠宰的生鲜稻花鸡，均已度过僵直期。预先紫外杀菌生鲜托盘和保鲜膜，鸡的外包装酒精消毒后迅速放入超净台中，用灭菌后的手术刀无菌割取完整鸡胸和鸡腿肉，每个预先消毒的生鲜托盘放置一块完整鸡胸肉和一只鸡腿，用保鲜膜覆盖托盘包装[15]，根据不同的实验要求分别置于25、4 和0 ℃贮藏。实验完成后，取鸡胸肉与鸡腿肉1:1 混合样本进行菌落总数的测定、假单胞菌属和肠杆菌科沙雷氏菌属的鉴定与测定。

1.3.2 假单胞菌属筛选及纯化鉴定

参考SN/T 4044-2014 《出口肉及肉制品中假单胞菌属的计数方法》，方法略作修改。称取0 ℃冰温贮藏8 d 的稻花鸡肉25 g，置于盛有225 mL 灭菌生理盐水锥形瓶中，8 000～10 000 r/min 均质2 min。10 倍系列稀释，选择3 个适宜稀释度样品均液，各取0.1 mL 接种到CFC 平板，涂布均匀，（25±1） ℃培养（44±4） h，挑选特征菌落进行氧化酶试验验证。挑选氧化酶阳性菌落，接种至LB 液体培养基中，（25±1） ℃培养（44±4） h 后划线CFC 培养基，（25±1） ℃培养（44±4） h，挑选特征菌落进行氧化酶试验，反复纯化6 代，进行鉴定。

1.3.3 肠杆菌科沙雷氏菌属筛选及纯化鉴定

参考GB 4789.41-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 肠杆菌科检验》，方法略作修改。称取0 ℃冰温贮藏8 d 的稻花鸡肉25 g，置于盛有225 mL BPW 锥形瓶中，8 000～10 000 r/min 均质2 min。10 倍系列稀释，选择3 个适宜稀释度样品均液，各取1 mL 分别加入无菌培养皿中，每皿倾注15 mL VRBGA 培养基，混匀，待琼脂凝固后，倾注一薄层VRBGA 培养基覆盖平板表层，（36±1） ℃，培养（24±1） h。挑选典型菌落（有或无沉淀环的粉红色至红色或紫色菌落）划线NA 平板，（36±1） ℃，培养（24±1） h。挑取菌落进行革兰氏染色镜检、氧化酶试验及葡萄糖发酵试验。选取革兰氏阴性、氧化酶阴性、葡萄糖发酵阳性菌落接种至LB 液体培养基中，（36±1） ℃培养24 h，后划线NA 培养基，（36±1） ℃培养24 h，进行革兰氏染色镜检、氧化酶试验及葡萄糖发酵试验，反复纯化6 代，进行鉴定。

1.3.4 优势腐败菌的16S rDNA鉴定

挑选纯化第6 代，初步鉴定为假单胞菌属和肠杆菌属的菌落，委托生工生物工程股份有限公司进行16S rDNA 全序列鉴定。

按SK8255（细菌）试剂盒操作提取基因组DNA，后进行PCR 扩增。扩增序列5′→3′，上游引物7FC：AGAGTTTGATCCTGGCT 下游引物1540R：AGGAGGTGATCCAGCCGCA， 反应体系为：Template（ 基因组DNA 20～50 ng/μL）0.5 μL，10×Buffer（with Mg2+）2.5 μL，dNTP（各2.5 mmol/L）1 μL， 酶0.2 μL， F（10 μmol/L）0.5 μL， R（10 μmol/L）0.5 μL，加双蒸H2O 至25 μL。PCR 循环条件为：94 ℃预变性4 min，94 ℃ 45 s、55 ℃ 45 s、72 ℃ 1 min、30 cycle，72 ℃修复延伸10 min，降温至4 ℃终止反应。用1%琼脂糖进行电泳，150 V、100 mA 电泳20 min。纯化回收：PCR 产物电泳条带切割所需DNA 目的条带，纯化方式见附见说明书（SK8131），PCR 产物用PCR 引物直接测序。测序结果分析：16S rDNA 序列在核糖体数据库http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp 上比对。

1.3.5 菌落总数的测定

参考GB 4789.2-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数》。

1.3.6 假单胞菌属菌落数的测定

参考SN/T 4044-2014《出口肉及肉制品中假单胞菌属的计数方法》。

1.3.7 肠杆菌科沙雷氏菌属菌落数的测定

参考GB 4789.41-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 肠杆菌科检验》。

1.3.8 菌落总数及优势腐败菌Arrhenius货架期预测模型的建立

食品品质在贮藏过程中的变化可用化学反应动力学方程式来反映。化学反应动力学的基本公式可表示为：

式中：

A——品质因子的浓度；

t——贮藏时间；

K——变化速率常数；

n——反应级数。

大多数食品的质量与时间关系表现出零级或一级的反应，即n=0 或n=1，动力学方程如下：

本实验检测25 ℃常温保存、4 ℃冷藏保鲜、0 ℃冰温贮藏3 种条件下菌落总数、假单胞菌属和肠杆菌科沙雷氏菌属，随贮藏时间变化的情况，通过对数据的整理，利用反应级数和反应速率常数进行推导Arrhenius 方程。通过不同温度贮藏过程中品质因子与贮藏时间的关系图，即可得出反应级数。阿仑尼乌斯（Arrhenius）方程如下：

式中：

T——绝对温度；

K0——方程常数；

Ea——为活化能，J/mol；

R——气体常数。

由式（1）和式（4），可得：

对式（5）积分后，可得贮藏过程中的品质变化通用动力学模型：

根据贮藏过程中品质因子的变化，结合公式（6）可得贮藏过程中菌落总数及优势腐败菌变化的动力学模型：

式中：

A0——初始菌落总数值、假单胞菌属值、沙雷氏菌属值；

At——贮藏t时间后的菌落总数值、假单胞菌属值、沙雷氏菌属值。单位为CFU/g。

1.3.9 数据分析

通过Microsoft Office Excel 2010 软件进行数据处理和统计分析，采用Prism 软件作图，SPSS 19.0软件进行动力学模型的构建。

2 结果与讨论

2.1 优势腐败菌的初步鉴定结果

纯化至6 代的菌落初步鉴定结果如表1 所示，根据参考标准，可初步认定为假单胞菌属和肠杆菌科沙雷氏菌属。

表1 纯化菌落初步鉴定结果Table 1 Preliminary identification results of purified colonies

2.2 优势腐败菌的16S rDNA鉴定结果

根据表2 可知，假单胞菌16S rDNA 全序列方法菌种鉴定结果为假单胞菌属中的莓实假单胞菌（Pseudomonas fragi）。莓实假单胞菌是肉源性假单胞菌属的优势菌，莓实假单胞菌是有氧贮藏条件下冷鲜牛肉、禽肉和海产品中的优势腐败菌[16]。根据表3 可知，肠杆菌16S rDNA 全序列方法菌种鉴定结果为沙雷氏菌属中的液化沙雷氏菌（Serratia liquefaciens）。液化沙雷氏菌是肠杆菌科，沙雷氏菌属中的条件致病菌，可以引起冷冻蔬菜及肉类制品腐败变质，是与食物中毒相关的最常见菌株之一[17]。本研究表明稻花鸡肉在贮藏过程中占主导地位的优势腐败菌为假单胞菌属中的莓实假单胞菌和肠杆菌科沙雷氏菌属中的液化沙雷氏菌，这与王光宇和Wang 等[18,19]研究结果一致。莓实假单胞菌随着贮藏时间的增加，在食品菌相体系中的优势地位越明显[20]，在肉中的污染比例高达 56.7%～79.0%[21,22]。莓实假单胞菌在肉制品中代谢活跃，可分解糖、蛋白质和脂肪等营养物质，导致肉品出现质构软化、变色、发黏，分解肉中的肽和氨基酸产生多种挥发性化合物，产生异味，通过胞外聚合物的作用抑制其他菌生长，成为优势腐败菌，且在肉制品表面形成大块菌落和黏液[23]。液化沙雷氏菌可引起肠炎、呼吸道感染、败血症等系列病变[24]，液化沙雷氏菌能发酵葡萄糖等产酸，分解蛋白质，水解邻-硝基酚-β-D-半乳糖苷（ONPG），可产生红色素，能够引起肉制品及蔬菜腐败变质，影响消费者的健康[25]。

表2 莓实假单胞菌鉴定结果Table 2 Identification results of Pseudomonas fragi

表3 液化沙雷氏菌鉴定结果Table 3 Identification results of Serratia liquefaciens

2.3 不同贮藏温度下菌落总数及优势腐败菌变化趋势

稻花鸡肉在25 ℃常温贮藏条件下微生物生长曲线如图1 所示。25 ℃常温保存条件下稻花鸡肉第0.5 天的菌落总数值为6.66 lg CFU/g，超过GB 16869-2005《鲜、冻禽产品》中规定鲜禽产品菌落总数≤1×106CFU/g 或6 lg CFU/g 规定限值。25 ℃常温贮藏条件下稻花鸡肉货架期不超过0.5 d，且在腐败中后期肠杆菌科沙雷氏菌属占主导地位，增长量高于假单胞菌属。腐败后期肠杆菌科沙雷氏菌属与菌落总数无显著性差异，均与假单胞菌有显著性差异。

图1 稻花鸡肉在25 ℃常温贮藏条件下微生物生长曲线Fig.1 Microbial growth curve of Daohua chicken under 25 ℃normal temperature storage

稻花鸡肉在4 ℃冷藏保鲜条件下微生物生长曲线如图2 所示。4 ℃冷藏保鲜条件下第4 天的菌落总数值为 6.77 lg CFU/g，超过国家标准规定限值。4 ℃冷藏保鲜条件下稻花鸡肉的货架期不超过4 d，且在腐败过程中，优势腐败菌假单胞菌属和肠杆菌科沙雷氏菌属均随贮藏时间呈增加趋势。贮藏前期和腐败后期，假单胞菌属和肠杆菌科沙雷氏菌属差异性不显著，但在整个贮藏过程中均与菌落总数有显著性差异。

图2 稻花鸡肉在4 ℃冷藏保鲜条件下微生物生长曲线Fig.2 Microbial growth curve of Daohua chicken under 4 ℃cold storage

稻花鸡肉在0 ℃冰温贮藏条件下微生物生长曲线如图3 所示。0 ℃冰温贮藏条件下第10 天的菌落总数值为6.94 lg CFU/g，超过国家标准规定限值。0 ℃冰温贮藏条件下稻花鸡肉的货架期不超过10 d，且在整个贮藏周期内，假单胞菌属、肠杆菌科沙雷氏菌属均呈缓慢增长的趋势。在贮藏后期假单胞菌属和肠杆菌科沙雷氏菌属差异性不显著，但均与菌落总数存在显著性差异。

图3 稻花鸡肉在0 ℃冰温贮藏条件下微生物菌生长曲线Fig.3 Microbial growth curve of Daohua chicken under 0 ℃ice storage

稻花鸡肉25 ℃常温贮藏下货架期不超过0.5 d，腐败中后期沙雷氏菌占主导地位，4 ℃冷藏保鲜货架期不超过4 d，假单胞菌和沙雷氏菌随贮藏时间呈增加趋势，0 ℃冰温贮藏货架期不超过10 d，贮藏后期假单胞菌属和肠杆菌科沙雷氏菌属差异性不显著。这是因为肠杆菌科菌属是嗜温好氧和兼性厌氧微生物，在25 ℃左右能良好生长[26,27]，而假单胞菌为好氧嗜冷菌，因此25 ℃常温保存条件下稻花鸡肉在腐败中后期占主导优势的腐败菌为肠杆菌科沙雷氏菌，且增长量显著高于假单胞菌。假单胞菌在有氧情况下，贮藏温度降低，生长优势明显[28-30]，且假单胞菌与肠杆菌科沙雷氏菌存在强相关性[31]，因此4 ℃冷藏保鲜和0 ℃冰温贮藏的稻花鸡肉在腐败后期是沙雷氏菌和假单胞菌占主导优势，且差异性不显著。

2.4 菌落总数、假单胞菌属和肠杆菌科沙雷氏菌属Arrhenius货架期预测模型的建立

根据图2、图3、图4 在不同贮藏温度下菌落总数、假单胞菌属、肠杆菌科沙雷氏菌属与贮藏时间的关系可知，3 个温度下菌落总数、假单胞菌属、肠杆菌科沙雷氏菌属均与时间t近似呈指数关系，菌落总数、假单胞菌属和肠杆菌科沙雷氏菌属的自然对数均与时间t近似呈线性关系，相关系数R2均在0.8 以上，根据（3）式可得在贮藏中菌落总数、假单胞菌属、肠杆菌科沙雷氏菌属的变化均为一级反应，即反应级数n=1。由菌落总数、假单胞菌属、肠杆菌科沙雷氏菌属与时间t成指数关系可知，对菌落总数、假单胞菌属和肠杆菌科沙雷氏菌属取自然对数后与时间t进行线性回归和相关性分析，可得到3 种不同贮藏温度下，不同微生物的反应速率常数。菌落总数的动力学参数见表4，假单胞菌属的动力学参数见表5，肠杆菌科沙雷氏菌属的动力学参数见表6。

表4 在不同贮藏温度下菌落总数的动力学参数Table 4 Kinetic parameters of the total number of colonies at different storage temperatures

表5 在不同贮藏温度下假单胞菌属的动力学参数Table 5 Kinetic parameters of Pseudomonas at different storage temperatures

表6 在不同贮藏温度下沙雷氏菌属的动力学参数Table 6 Kinetic parameters of Serratia liquefactionat different storage temperatures

根据（4）式对反应速率常数K 及温度T 进行回归，得到菌落总数变化的活化能Ea=57 967 J/mol，反应常数K0=7.87×1010，平均相关系数R2在0.88 以上，能较好的反映样品中菌落总数随时间变化的反应速率常数与贮藏温度的关系。

将活化能Ea=57 967 J/mol，反应常数K0=7.87×1010代入式（7）可得：

式（8）可用来预测不同贮藏温度下稻花鸡肉的货架期。

根据（4）式对反应速率常数K 及温度T 进行回归，得到假单胞菌变化的活化能Ea=48 634 J/mol，反应常数K0=1.70×109，平均相关系数R2在0.90 以上，能较好的反映样品中假单胞菌随时间变化的反应速率常数与贮藏温度的关系。

将活化能Ea=48 634 J/mol，反应常数K0=1.70×109代入式（7）可得：

式（9）可用来预测不同贮藏温度下稻花鸡肉的货架期。

根据（4）式对反应速率常数K 及温度T 进行回归，得到肠杆菌科沙雷氏菌属变化的活化能Ea=60 922 J/mol，反应常数K0=3.79×1011，平均相关系数R2在0.95 以上，能较好的反映样品中肠杆菌科沙雷氏菌属随时间变化的反应速率常数与贮藏温度的关系。

将活化能Ea=60 922 J/mol，反应常数K0=3.79×1011代入式（7）可得：

式（10）可用来预测不同贮藏温度下稻花鸡肉的货架期。

2.5 Arrhenius货架期预测模型的验证

根据GB 16869-2005《鲜、冻禽产品》规定，可食用鲜禽的菌落总数值≤1×106CFU/g。因此可以确定菌落总数限制值为1×106CFU/g，而假单胞菌属、肠杆菌科沙雷氏菌属没有国家标准规定的具体限制值，则根据前期实验25 ℃常温保存稻花鸡的货架期为0.5 d，假单胞菌属值为6.1×105CFU/g，肠杆菌科沙雷氏菌属值为1.4×105CFU/g。4 ℃冷藏保鲜稻花鸡的货架期为4 d，假单胞菌属值为3.6×106CFU/g，肠杆菌科沙雷氏菌属值为4×106CFU/g。0 ℃冰温贮藏稻花鸡的货架期为8 d，假单胞菌属值为6.1×105CFU/g，肠杆菌科沙雷氏菌属值为4.8×105CFU/g。分别取25、4、0 ℃货架期终点时假单胞菌和沙雷氏菌的中间值作为限制值，因此假单胞菌的限制值为6.1×105CFU/g、肠杆菌科沙雷氏菌属的限制值为4.8×105CFU/g，菌落总数，假单胞菌属，肠杆菌科沙雷氏菌属货架期预测模型的验证如下表7 所示，通过与实测各指标到达限制值时的货架期进行对比，验证3 种货架期预测模型的精确性。

表7 稻花鸡肉货架期预测值和实测值Table 7 Shelf life prediction and measured values of Daohua chicken

货架期预测模型的预测值与实测值平均相对误差在15%以内即可，结果如表7 所示，本实验建立的稻花鸡肉3 种货架期预测模型相对误差最大的为菌落总数货架期预测模型11.58%，其次沙雷氏菌货架期预测模型的相对误差为7.04%，假单胞菌属货架期预测模型的相对误差仅为6.48%。3 个货架期预测模型的误差均在允许范围内，表明菌落总数货架期预测模型、假单胞菌属货架期预测模型、肠杆菌科沙雷氏菌属货架期预测模型均可有效的预测稻花鸡肉的货架期，其中预测效果最佳的为假单胞菌属货架期预测模型，相对误差仅为6.48%，且贮藏温度越低，货架期越久，3 个货架期预测模型的预测效果越好。

3 结论

本研究表明稻花鸡肉在贮藏过程中占主导地位的优势腐败菌为假单胞菌属中的莓实假单胞菌和肠杆菌科沙雷氏菌属中的液化沙雷氏菌。稻花鸡肉25 ℃常温贮藏下货架期不超过0.5 d，腐败中后期沙雷氏菌占主导地位，4 ℃冷藏保鲜货架期不超过4 d，假单胞菌和沙雷氏菌随贮藏时间呈增加趋势，0 ℃冰温贮藏货架期不超过10 d，腐败后期假单胞菌属和沙雷氏菌属差异性不显著。利用菌落总数、假单胞菌、沙雷氏菌3 个指标建立的货架期预测模型分别为经过验证，3 种货架期预测模型均能对各自的指标进行真实的预测，预测效果最佳的为假单胞菌属货架期预测模型，其相对误差仅为6.48%，其次是沙雷氏菌货架期预测模型的相对误差为7.04%，菌落总数货架期预测模型为11.58%，相对误差均在允许范围内。综上，稻花鸡肉优势腐败菌为莓实假单胞菌和液化沙雷氏菌，降低温度能够延长其货架期，且构建的3 个货架期预测模型均能良好的监控其货架期。